A ocupação do local de N-glicosilação é uma característica fisiológica das glicoproteínas e produz principalmente N-glicano. O serviço de análise de ocupação do local de N-glicosilação da Yaohai Bio-Pharma é conduzido por meio de digestão, liberação, enriquecimento e análise usando Cromatografia Líquida-Ionização por Eletrospray Espectrometria de Massa-Espectrometria de Massa (LC-ESI-MS/MS).
Estamos envolvidos na caracterização estrutural de proteínas de várias moléculas grandes, incluindo vacinas de subunidades recombinantes, nanocorpos/VHHs/anticorpos de domínio único (sdAbs), fragmentos de anticorpos, hormônios/peptídeos, citocinas, fatores de crescimento (GF), enzimas, colágenos, etc.
Requisitos regulatórios para ocupação do local de N-glicosilação
De acordo com a diretriz ICH Q6B, “para glicoproteínas, o conteúdo de carboidratos (açúcares neutros, aminoácidos e ácidos siálicos) é determinado. Além disso, a estrutura das cadeias de carboidratos, o padrão de oligossacarídeos (perfil antenar) e o(s) local(is) de glicosilação da cadeia polipeptídica são analisados na melhor extensão possível.”
Método Analítico
| Análise |
De Depósito |
| Ocupação do local de N-glicosilação |
LC-MS após digestão com desglicosilase e protease |
Procedimentos
1. Digestão proteica de proteínas para gerar pequenos fragmentos peptídicos.
2. Liberação de N-glicano usando endoglicosidase H ou PNGase F. A endoglicosidase H cliva a ligação entre os dois resíduos GlcNAc no núcleo dos glicanos ligados a N, enquanto PNGase F é uma glicoamidase que rompe a ligação entre GlcNAc e Asn, liberando todo o cadeia de açúcar e conversão de Asn em Asp com aumento de massa de 1-Da.
3. Enriquecimento de N-glicopeptídeo via HILIC (cromatografia líquida de interação hidrofílica)
4. Análise da ocupação do local de glicosilação ligada a N usando LC-ESI-MS/MS.
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