Oplåsning af hemmeligheder af højkvalitets plasmidekstraktion

Plasmidudvinding er afgørende for forskere. Som genvektorer er plasmider vitale i vaccineforskning og genterapi, hvor kvaliteten betyder noget. Nøglekvalitetsfaktorer omfatter supercoiled andel og endotoksinindhold. Reglerne varierer: FDA ≥80 %, SMPA ≥85 %, NMPA ≥90 %, med <5 % lineært/åbent cirkulært DNA. Kunder foretrækker ofte ≥95 % supercoiled. Endotoksinniveauer er: forskning (>50 EU/µg), transfektion (<50 EU/µg) og endotoksinfri (<0.1 EU/µg).

Supercoiled plasmid DNA

Plasmider fra Escherichia coli inkluderer supercoiled (SC), åben-cirkulær (OC) og lineær (L) DNA. Høj SC-andel øger transfektionseffektivitet og ekspression. For eksempel er en 85.45% SC-plasmids transfektion 2.5x højere, og et 93.28% SC-plasmids HGF-ekspression er 1.8x højere, hvilket bekræfter SC-DNA's overlegenhed.

Åbent cirkulært DNA: Når en streng af dobbeltstrenget DNA går i stykker, bliver den supersnoede struktur løs og danner et åbent cirkulært plasmid med et større volumen, der migrerer langsomst under elektroforese og er placeret i toppen.

Lineær DNA: Når begge strenge af plasmid-DNA går i stykker, dannes der en lineær struktur med et relativt mindre volumen, der migrerer hurtigere end åbent cirkulært DNA, men langsommere end supercoiled DNA, placeret som nummer to.

Supercoiled DNA: To helixer flettes ind i hinanden og snoer sig til en supercoiled struktur baseret på DNA-helixen. Den har det mindste volumen og migrerer hurtigst under elektroforese, placeret i bunden.

Kvantitativ Analyse af Supercoiled Proportion

Labs bruger agarosegelelektroforese (AGE) og Gel-Pro Analyzer til at bedømme supercoiled proportion via elektroforesebilleder. Et billede viser 97.539% SC DNA, mens et andet viser 63.833% SC og 36.167% OC DNA (lineær DNA ikke synlig).

Hemmeligheden bag endotoksin i plasmider

Endotoksin er en komponent i det ydre lag af cellevæggen af ​​gramnegative bakterier, frigivet efter bakteriel død eller lysis, indeholdende toksisk lipopolysaccharid A. Under plasmidekstraktion trænger endotoksin ind i lysisopløsningen, hvilket påvirker transfektionseffektiviteten og udløser uspecifikke immunresponser, hvilket fører til til falske positive i eksperimenter.

Kvantitativ og kvalitativ analyse af endotoksin

Limulus amebocytlysat (LAL) testen påviser endotoksin via agglutination med 2-keto-3-deoxyoctonsyre (KDO) i lipopolysaccharidet (LPS). Det er kvalitativt og semikvantitativt, hvilket indikerer tilstedeværelse af endotoksin gennem koagulering eller farveændring, når det blandes med prøver.

Yaohai Bio-Pharma tilbyder endotoksin-fri supercoiled plasmider. Outsourcing til Yaohai øger transfektion og ekspressionseffektivitet. Leverede plasmider har en ≥95 % SC-andel (gennemsnitlig 85 %±10 %) og endotoksinniveauer ≤0.1, ≤0.01 eller ≤0.005 EU/μg.

Vi søger også aktivt institutionelle eller individuelle globale partnere. Vi tilbyder den mest konkurrencedygtige kompensation i branchen. Hvis du har spørgsmål, er du velkommen til at kontakte os: [email protected]