Afslører hemmelighederne om høj kvalitet plasmid ekstraktion

Ekstraktion af plasmid er afgørende for forskere. Som genvektorer er plasmider vigtige i vaccinforskning og geneterapi, hvor kvalitet har betydning. Nøgletal for kvalitet omfatter supercoiled-proportion og endotoxin-indhold. Bestemmelser varierer: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, med <5% lineær/åben-cirkulær DNA. Kunder foretrækker ofte ≥95% supercoiled. Endotoxin-niveauer er: forskning (>50 EU/µg), transfektion (<50 EU/µg) og endotoxin-fri (<0.1 EU/µg).

Supercoiled Plasmid-DNA

Plasmider fra Escherichia coli omfatter supercoiled (SC), åben-cirkulær (OC) og lineær (L) DNA. Et højt SC-proportion forbedrer transfektions-effektiviteten og udtrykket. For eksempel er en 85.45% SC-plasmids transfektion 2.5 gange højere, og en 93.28% SC-plasmids HGF-udtryk 1.8 gange højere, hvilket bekræfter SC DNAs overlegenhed.

Åben-cirkulær DNA: Når én af de to strikke i dobbeltstrandede DNA brydes, bliver supercirklede strukturen løsere, hvilket dannet en åben-cirkulær plasmid med større volumen, der migrerer langsomst under elektroforesen og befinder sig øverst.

Lineært DNA: Når begge strikker af plasmid-DNA brydes, dannes en lineær struktur med relativt mindre volumen, der migrerer hurtigere end åben-cirkulært DNA, men langsommere end supercirklet DNA, placeret på andenpladsen.

Supercirklet DNA: De to helixer forvæver sig, hvilket resulterer i en supercirklet struktur baseret på DNA-helixen. Den har det mindste volumen og migrerer hurtigst under elektroforesen, placeret nederst.

Kvantitativ analyse af supercirklet proportion

Laboratorier bruger agarose gel elektrofores (AGE) og Gel-Pro Analyzer til at vurdere supercirklet proportion via elektrofores billeder. Et billede viser 97,539% SC DNA, mens et andet viser 63,833% SC og 36,167% OC DNA (lineært DNA ikke synligt).

Hemmeligheden bag endotoxin i plasmider

Endotoxin er en komponent i den ydre lag af cellevæggen hos Gram-negative bakterier, der frigives efter bakteriel død eller lysning og indeholder toksisk lipopolysaccharide A. Under plasmidudtrækning går endotoxin ind i lysningsløsningen, hvilket påvirker transfektionsefficiencen og udløser ikke-specifikke immunresponser, hvilket kan føre til falske positive resultater i eksperimenterne.

Kvantitativ og kvalitativ analyse af endotoxin

Limulus amebocyte lysat (LAL)-testet registrerer endotoxin via agglutination med 2-keto-3-deoxyoktansyre (KDO) i lipopolysacchariden (LPS). Den er både kvalitativ og semi-kvantitativ, hvorved endotoxins tilstedeværelse vises ved koagulation eller farveændring, når det blanding med prøver.

Yaohai Bio-Pharma tilbyder endotoxinfrie supercirkulære plasmider. At udbyde arbejdet til Yaohai forbedrer transfektions- og ekspresionsefficiencen. Leverede plasmider har en ≥95% SC-proportion (gns. 85%±10%) og endotoxin niveauer ≤0.1, ≤0.01 eller ≤0.005 EU/μg.

Vi søger også aktivt globale partnere, både institutionelle og individuelle. Vi tilbyder den mest konkurrencedygtige kompensation i branchen. Hvis du har nogen spørgsmål, tøv ikke med at kontakte os: [email protected]