У супоставленні з двухэтапнай энзыматычнай капсуваннай, аднаэтапны спосаб спачатковай капсуванні можа значна спрасці процэс. Гэты метад заснаваны на дадзенні кап-аналагаў да реакцыі транскрыпцыі вяршэння (IVT). Кап-аналогі могуць быць ўведзеныя ў час транскрыпцыі, і пасля яе завяршэння атрымліваецца mRNA з кап-структурай. Сучасныя трэцяга паколеньня кап-аналогі могуць уяўляць кап 1 структуру напрамую без зваротнай капсуванні.
У звязку з імунагеннасцю mRNA ў живых арганізмах і эфектыўнасцю трансляцыі, працэс IVT часта выкарыстоўвае пэўныя тыпы модифікаваных НТП, і часта ўжываліся модифікаваныя нуклеатыды: псевдуюрыдыны (Ψ), N1-метыл-псевдуюрыдына (N1Ψ) і 5-метылсытызін (5mC).
Рысунак: Схема кутранскрыпцыйнай капінга mRNA
Сервіс |
Дэталі сервісу |
Тэрмін выканання (робальны дзень) |
Кутранскрыпцыйнае капінга |
Эксперыментальная транскрыпцыя ў тэsts (Чысты аналог капа) | 1-2 |
Модифікацыі нуклеатадаў (Ψ/ N1Ψ/ 5mC) | ||
Выдаленне ДНК-шаблона (ДНаза I) | ||
Аптымізацыя умоваў IVT - неабходна |
Дызайн і аптымізацыя кампанентаў реакцыі | 3-7 |
Колькіść даступных стратэгій нуклеатаднай модыфікацыі можа павысіць экспрэсію белка.
Дасягнуць высоцеі пропорцыі транскрыпцыі і высоцеі эфектыўнасці капіння.
Дасягнуць ступені капіння больш за 95%.
Эфектыўна спраўляць з дэградацыяй mRNA праз сціліўную кантроль RNase ў эксперыментальнай сродовіне і патрабах.
Yaohai Bio-Pharma усталяла дозрэлы платфармую працэсу спалучнага капінга, выкарыстоўваючы чыстыя кап-аналогі, каб напрамую дадаць структуру Cap1, узяўшы ў улік абвежанне адваротнага капінгу. Пасля стандартнай папярэдняй абароцкі пробы і дэтэкцыі капілярнай электрафарэз (CE), ступень капінгу mRNA збуйнага зеленага флуорэсцэнтнага белка (eGFP) можа дасягнуць больш 95%.
эфектыўнасць капінгу mRNA eGFP больш 95%
MRNA eGFP і mRNA mCherry, падгатаваныя спалучным капінгам, трансфіруюцца ў клеткі 293T адпаведна, і пасля 48 гадзін наблізуецца сільны флуорэсцэнтны сигнал, што свідоміць аб тым, што mRNA ефектыўна экспрыміруецца ў клетках 293T.
Экспрысія mRNA eGFP і mRNA mCherry ў клетцы 293T