بالنسبة لإنتاج mRNA على نطاق واسع، يعتبر النسخ الرباعي في المختبر (IVT) طريقة أكثر كفاءة ونضجاً. يستخدم التفاعل IVT البلازميد الخطي الذي يحتوي على منشأ T7 كقالب، ويتم تصنيع mRNA باستخدام ثلاثيات النوكليوتيدات (NTPs) كمواد أولية وفي وجود بوليمراز RNA T7.
تعديل النوكليوتيدات هو اختراق في استكشاف الحمض النووي الريبي المرسال (mRNA)، حيث يتم التعرف على جزيئات mRNA غير المعدلة بواسطة مستشعرات RNA داخل الخلايا لتفعيل المناعة الطبيعية. بناءً على اعتبارات مناعية للحمض النووي الريبي المرسال داخل الجسم وفعالية الترجمة، فإن عملية IVT عادة ما تستخدم أنواعًا معينة من NTPs المعدلة، والتعديلات الشائعة هي اليوريدين المزيف (Ψ)، والميثيل-1-اليوريدين المزيف (N1Ψ)، وسيتوزين الميثيل-5 (5mC).
رسم تخطيطي لرد فعل النسخ الريبي خارج الجسم (IVT)
خدمات إضافية متاحة |
تفاصيل الخدمة |
فترة التسليم (يوم عمل) |
النسخ الاصطناعي (IVT) |
IVT، النسخ الريبي خارج الجسم | 1 |
تعديلات النوكليوتيدات (Ψ/N1Ψ/5mC، إلخ.) | ||
إزالة القالب ال DNA (إنزيم DNase I) | ||
تحسين ظروف IVT - اختياري |
تصميم وتحسين مكونات استجابة IVT | 2-5 |
تحسين استقرار mRNA والتعبير عن البروتين في الجسم الحي.
يمكن تحقيق إعداد شظايا mRNA حتى 10kb.
من خلال تحسين ظروف استجابة IVT، يكون معدل النسخ يصل إلى 1:200.
التحكم الصارم في RNase من خلال بيئة التجربة والمواد الاستهلاكية يمكن أن يمنع بشكل فعال تحلل mRNA.
نظام استجابة IVT الحالي تم تحسينه تقريبًا للأنظمة الاصطناعية التي طولها حوالي 100 نوكليوتي드، وليس للـ mRNAs ذات الأطوال العشوائية. كلما زاد طول سلسلة mRNA، أصبح من الصعب نسخها وأكثر عرضة للتدهور.
من أجل إعداد سلاسل mRNA مخصصة بطول حوالي 10 كيلو باس، تمكنت شركة Yaohai Bio-Pharma بنجاح من إعداد عينات ذات جودة عالية بنسبة نسخ عالية بلغت 1:135 والحصول على 135 ميكروغرام من منتجات mRNA المُنقاة بشكل أولي بعد أن تم نسخ 1 ميكروغرام من البلازميد المُستقيم خارجياً من خلال تصميم تجريبي دقيق، وتحسين مستمر لظروف التفاعل، ورقابة صارمة على RNase.
تحديد mRNA (التفريغ الكهربائي على غلالة الأغاريوز)