Capping na końcu 5' jest zasadniczą modyfikacją mRNA. mRNA ze strukturami czapeczki, szczególnie struktury Cap1, ułatwiają mRNA unikanie wrodzonych odpowiedzi immunologicznych in vivo, co skutkuje wydajną translacją białek.
Capping enzymatyczny (metoda dwuetapowa) to konwencjonalna metoda cappingu mRNA, podobna do procesu cappingu w organizmach eukariotycznych. Pod działaniem szeregu enzymów 7-metyloguanina (m7G) łączy się z końcem 5' mRNA poprzez wiązanie trifosforanowe 5'-5' i ulega modyfikacji metylacyjnej, tworząc strukturę czapeczki Cap 1 (m7GpppN).
Schemat powstawania naturalnej struktury czapki
Przebieg reakcji enzymatycznego zamykania jest następujący:
Linearyzowany plazmidowy DNA stosuje się jako matrycę do transkrypcji in vitro (IVT) w obecności polimerazy T7, a mRNA ze strukturą 5'-end cap powstaje po jednoetapowym oczyszczaniu przy użyciu enzymu zamykającego krowiankę i 2'-O -metylotransferaza.
Szczegóły usług
Usługa opcjonalna | Szczegóły usługi | Okres dostawy (dzień) |
Kapowanie enzymatyczne mRNA | Enzymatyczna reakcja zamykania | 1 |
Optymalizacja reakcji zamykania - opcjonalnie | Projektowanie i optymalizacja elementów reakcji | 3 ~ 7 |
Nasze funkcje
- Projektowanie i optymalizacja składnika reakcji zamykania
Składnik reakcji zamykania jest zoptymalizowany, a wytwarzanie transkryptu mRNA znacznie wzrasta.
- Weryfikacja ekspresji in vitro
Zamknięty mRNA transfekuje się do komórek 293T i można wykryć ekspresję docelowego białka.
Dzięki ścisłej kontroli środowiska eksperymentalnego RNaseson i materiałów eksploatacyjnych skutecznie zapobiega się degradacji mRNA.
Case study
Platforma mRNA firmy Yaohai Bio-Pharma stworzyła doskonały proces reakcji zamykania.
W przypadku mRNA eGFP, preproduktu mRNA przygotowanego przez enzymatyczne zamykanie, sygnał fluorescencji eGFP (zielona fluorescencja) na wysokim poziomie można zaobserwować po transfekcji komórek 293T przez 24 godziny, co wykrywa się metodą Western Blot (WB), wykazując, że Docelowe białko wzmocnione zieloną fluorescencją (eGFP) może być skutecznie wyrażane in vitro.
Ekspresja mRNA eGFP zakończonego enzymatycznie w komórce 293T
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NIE
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
