Jeśli chodzi o masową produkcję mRNA, transkrypcja in vitro (IVT) jest bardziej wydajną i dojrzałą metodą. W reakcji IVT jako matrycę wykorzystuje się linearyzowany plazmidowy DNA zawierający promotor T7, a mRNA syntetyzuje się z trifosforanami nukleozydów (NTP) jako substratami w obecności polimerazy RNA T7.
Modyfikacja nukleotydów stanowi przełom w eksploracji mRNA, gdzie niezmodyfikowane cząsteczki mRNA są rozpoznawane przez wewnątrzkomórkowe czujniki RNA w celu aktywacji wrodzonej odporności. Ze względu na immunogenność i skuteczność translacji mRNA in vivo w procesie IVT zwykle wykorzystuje się pewne rodzaje zmodyfikowanych NTP, a powszechnie stosowanymi modyfikowanymi nukleotydami są pseudourydyna (Ψ), N1-metylopseudourydyna (N1Ψ) i 5-metylocytozyna (5mC).
Proces transkrypcji mRNA in vitro
Schemat reakcji transkrypcji in vitro (IVT).
Szczegóły usług
Usługa opcjonalna | Szczegóły usługi | Okres dostawy (dzień roboczy) |
Transkrypcja in vitro (IVT) | IVT, transkrypcja in vitro | 1 |
| Modyfikacje nukleotydów (Ψ/N1Ψ/5mC itp.) |
| Usuwanie matrycy DNA (DNaza I) |
Optymalizacja stanu IVT – opcjonalna | Projektowanie i optymalizacja komponentów reakcji IVT | 2-5 |
Nasze funkcje
- Zróżnicowane strategie modyfikacji nukleotydów
Popraw stabilność mRNA i ekspresję białka in vivo.
- Rygorystyczne projektowanie i optymalizacja testów
Można uzyskać fragment mRNA o wielkości do 10 kb.
Optymalizując warunki reakcji IVT, szybkość transkrypcji wynosi do 1:200.
Ścisła kontrola RNazy za pomocą środowiska eksperymentalnego i materiałów eksploatacyjnych może skutecznie zapobiegać degradacji mRNA.
Studium przypadku
Obecny system reakcji IVT jest z grubsza zoptymalizowany dla układów syntetycznych o długości około 100 nt, a nie dla mRNA o dowolnej długości. Im dłuższa sekwencja mRNA, tym trudniejsza do transkrypcji i tym bardziej podatna na degradację.
W celu przygotowania spersonalizowanych sekwencji mRNA o długości około 10 kb, Yaohai Bio-Pharma z sukcesem przygotowała wysokiej jakości próbki o wysokim współczynniku transkrypcji 1:135 i uzyskała 135 µg wstępnie oczyszczonych produktów mRNA po 1 µg linearyzowanego plazmidu transkrybowano in vitro poprzez rygorystyczny projekt eksperymentalny, ciągłą optymalizację warunków reakcji i ścisłą kontrolę RNazy.
Identyfikacja mRNA (elektroforeza w żelu agarozowym)
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NIE
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
