Jeśli chodzi o przygotowanie wsadowe prekursorów RNA, powszechnie stosowaną metodą jest transkrypcja in vitro (IVT). Reakcja IVT wykorzystuje linearyzowany plazmidowy DNA zawierający promotor T7 jako matrycę i syntetyzuje prekursor RNA z trifosforanami nukleozydów (NTP) jako substratem w obecności polimerazy RNA T7.
Metody cyklizacji in vitro obejmują ligację chemiczną, ligację enzymatyczną i metodę permutowanego intronu-eksonu (PIE). Ligacja chemiczna i ligacja enzymatyczna są odpowiednie do cyklizacji krótszych RNA. Gdy fragment jest większy niż 100 nt, szybkość cyklizacji znacznie się zmniejszy. Natomiast metoda nukleazowa oparta na systemie PIE może osiągnąć cyklizację sekwencji o wielkości 8 kb.
Pod wpływem katalizy trifosforanu guanozyny (GTP) struktura PIE ulega cyklizacji sekwencji pozaintronowych. W połączeniu z rozsądną strategią zwiększania szybkości cyklizacji, Yaohai Bio-Pharma może osiągnąć cyklizację sekwencji o wielkości do 4 kb, przy wydajności cyklizacji przekraczającej 80%.
Reakcja cyklizacji RNA in vitro przebiega następująco:
Prekursor RNA jest syntetyzowany poprzez transkrypcję in vitro, a składnik PIE kończy samosplicing pod katalizą GTP, tworząc circRNA.
Szczegóły usług
| Przetwarzanie | Szczegóły usługi | Okres dostawy (dzień roboczy) |
| Transkrypcja i krążenie in vitro | Potwierdzenie układu reakcyjnego | 1-2 |
| Reakcje transkrypcji i cyklizacji in vitro |
| Trawienie RNazą R |
| Optymalizacja reakcji | Skład reakcji, optymalizacja czasu | 2-5 |
Nasze funkcje
- Rygorystyczne projektowanie i optymalizacja testów
Można osiągnąć do 4 kb cyklizacji RNA.
- Wysoka wydajność cyklizacji
Stopień cyklizacji większy niż 80% można osiągnąć poprzez racjonalną strategię optymalizacji sekwencji.
Dzięki rygorystycznej kontroli RNaz w środowisku doświadczalnym i materiałach eksploatacyjnych skutecznie zapobiega się degradacji RNA.
Case study
Cyklizacja in vitro i wzbogacanie circRNA
W oparciu o system PIE firma Yaohai Bio-Pharma zoptymalizowała sekwencję circRNA, przy współczynniku cyklizacji wynoszącym ponad 80% metodą elektroforezy w żelu agarozowym (AGE). Wyniki elektroforezy w żelu E przy użyciu RNazy R do wzbogacenia circRNA pokazują, że liniowy prekursor RNA jest trawiony, a po dalszym oczyszczaniu większość naciętego circRNA można usunąć. Rozwiązanie oczyszczające zostało opracowane samodzielnie przez Yaohai Bio-Pharma.
Cyrkulacja in vitro i wzbogacanie circRNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NIE
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
