W przypadku masowej produkcji mRNA, transkrypcja in vitro (IVT) jest bardziej wydajną i dojrzałą metodą. Reakcja IVT używa liniowego DNA plazmidowego zawierającego promotor T7 jako szablonu, a mRNA syntetyzuje się z nukleotydów tryfosforanowych (NTP) jako substratów w obecności polimerazy RNA T7.
Modyfikacja nukleotydów to przełom w badaniach nad mRNA, gdzie niezmodyfikowane molekuły mRNA są rozpoznawane przez wewnętrznekomórkowe czujniki RNA, aktywując odporność wrodzoną. Ze względu na immunogeniczność mRNA in vivo i efektywność translacji, proces IVT zwykle wykorzystuje pewne rodzaje zmodyfikowanych NTP, a powszechnie stosowane zmodyfikowane nukleotydy to pseudourydyna (Ψ), N1-metyl-pseudourydyna (N1Ψ) i 5-metylcytozyna (5mC).
Proces transkrypcji in vitro mRNA
Schemat reakcji transkrypcji in vitro (IVT)
Szczegóły usług
Opcjonalne Usługi |
Szczegóły usług |
Okres dostawy (dzień roboczy) |
Transkrypcja in vitro (IVT) |
IVT, Transkrypcja in vitro |
1 |
| Modyfikacje nukleotydowe (Ψ/N1Ψ/5mC itp.) |
| Usunięcie szablonu DNA (DNaza I) |
Optymalizacja warunków IVT - opcjonalnie |
Projektowanie i optymalizacja składników reakcji IVT |
2-5 |
Nasze cechy
- Zróżnicowane strategie modyfikacji nukleotydów
Poprawa stabilności mRNA i wyrażenia białka in vivo.
- Swoista konstrukcja i optymalizacja testów
przygotowanie fragmentu mRNA o długości do 10kb jest możliwe.
Dzięki optymalizacji warunków reakcji IVT, temp transkrypcji wynosi aż 1:200.
- Swoisty kontrolowany RNase
Surowa kontrola RNase za pomocą środowiska laboratoryjnego i zużywalnych materiałów może skutecznie zapobiec degradacji mRNA.
Badanie przypadków
Obecny system reakcji IVT jest w przybliżeniu zoptymalizowany dla systemów syntetycznych o długości około 100 nt, nie dla mRNA o dowolnej długości. Im dłuższy jest ciąg mRNA, tym trudniej go transkrybować i tym bardziej podatny na degradację.
Aby przygotować zindywidualizowane sekwencje mRNA o długości około 10 kb, Yaohai Bio-Pharma pomyślnie przygotowała wysokiej jakości próbki z wysokim współczynnikiem transkrypcji wynoszącym 1:135 i uzyskała 135 μg początkowo oczyśćonych produktów mRNA po transkrypcji in vitro 1 μg plazmy liniowej dzięki ścisłemu projektowi eksperymentalnemu, ciągłej optymalizacji warunków reakcji oraz surowemu kontrolowaniu RNase.
identyfikacja mRNA (elektroforeza w gelu agarowym)
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
