Optimierung des Aufreinigungsprozesses für rekombinantes Humaninsulin

In den letzten Jahren hat die steigende Zahl von Diabetespatienten die Nachfrage nach Insulin erhöht, doch erschwingliches Insulin ist knapp. Eine effiziente und kostengünstige Insulinproduktion ist von entscheidender Bedeutung. Da E. coli aufgrund seines schnellen Wachstums und seiner geringen Kosten hauptsächlich aus Escherichia coli (E. coli) und Hefen hergestellt wird, ist eine komplexe Weiterverarbeitung erforderlich.

Übersicht zur Downstream-Verarbeitung:

Die Reinigung von rekombinantem Humaninsulin aus Einschlusskörpern von E. coli umfasst mehrere Schritte, darunter Rückgewinnung, Waschen, Solubilisierung und Oxidation, Spaltung, Pufferaustausch, chromatographische Reinigung, Fällung, Renaturierung, enzymatische Spaltung und Formulierung.

Yaohai Bio-Pharma verfügt über umfangreiche Erfahrung in der Produktion und Reinigung von rekombinantem Insulin und verfügt über ein Expertenteam, das dafür sorgt, dass Ihre Insulinproduktion mit hoher Effizienz erfolgt. Auf der Grundlage unserer Erfahrung aus Hunderten von Projekten fasst Yaohai zusammen, wie der Downstream-Reinigungsprozess für rekombinantes Humaninsulin optimiert werden kann.

Rückgewinnung und Waschen von Einschlusskörpern:

Die Zellen werden mit mechanischen Methoden (wie Ultraschall, Hochdruckhomogenisierung) oder Lysozymbehandlung aufgebrochen, gefolgt von Waschpuffern (mit Harnstoff, Triton X-100 usw.), um Verunreinigungen zu entfernen. Während des Waschens müssen die Parameter optimiert werden, um die Proteinqualität sicherzustellen und gleichzeitig die Kosten unter Kontrolle zu halten.

Solubilisierung und Oxidation von Einschlusskörpern:

Zur Solubilisierung von Einschlusskörpern werden hochkonzentrierte Denaturierungsmittel (wie Guanidinhydrochlorid und Harnstoff) verwendet. Zur Vermeidung der Bildung falscher Disulfidbindungen werden Dithiothreitol oder β-Mercaptoethanol zugesetzt. pH-Wert und Temperatur beeinflussen die Solubilisierungs- und Oxidationsreaktionen erheblich.

Spaltung und Pufferaustausch:

Die Spaltung mit Cyanogenbromid wird verwendet, um die N-terminale Startaminosäure zu entfernen, sie ist jedoch mit Toxizität und geringer Spezifität verbunden. Durch Dialyse, Ultrafiltration oder Größenausschlusschromatographie werden durch Pufferaustausch schädliche Reagenzien entfernt, um sie für nachfolgende Operationen vorzubereiten.

Chromatographische Reinigung und Fällung:

Zur Reinigung von Insulin werden mehrere chromatographische Techniken eingesetzt, darunter Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie und Größenausschlusschromatographie. Fällungsmethoden wie pH-Fällung und Zinkkristallisation werden verwendet, um Verunreinigungen zu entfernen und Proteine ​​zu konzentrieren.

Renaturierung:

Das gelöste Protein wird in einem Renaturierungspuffer verdünnt, um die korrekte Bildung von Disulfidbindungen und die Proteinfaltung zu fördern. Proteinfaltungsflüssigkeitschromatographie und Dialyse sind weitere Methoden zur Renaturierung.

Enzymatische Spaltung und Formulierung:

Trypsin und Carboxypeptidase B werden verwendet, um das C-Peptid zu spalten, wodurch das aktive Insulin-Heterodimer entsteht. Abschließend werden Kristallisation und Gefriertrocknung eingesetzt, um restliche Salze und Puffer zu entfernen und eine stabile Formulierung herzustellen. Um unterschiedliche klinische Anforderungen zu erfüllen, werden spezifische Zusatzstoffe (wie Zink und Protamin) hinzugefügt.

Fazit:

Downstream-Verarbeitung von Insulin aus E. coli ist komplex. Der Schwerpunkt sollte künftig auf der Optimierung dieser Schritte liegen, um eine effiziente, wirtschaftliche Produktion zu gewährleisten, die die Nachfrage erfüllt und die Kosten senkt.

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