Optimierung der Zellintegrität von E. coli für die Biopharma-Produktion

Im Bereich der Biopharmazie spielt Escherichia coli (E. coli) eine wichtige Rolle als Wirt für die Expression rekombinanter Proteine. Die zelluläre Integrität von E. coli ist entscheidend für Proteinausbeute, -qualität und -produktionskosten. Diese Integrität betrifft in erster Linie die Struktur und Funktion der inneren Membran (IM) und der äußeren Membran (OM).

Yaohai Bio-Pharma verfügt über 15 Jahre Erfahrung in der Fermentation von E. coli und der Expression von rekombinantem Protein. Wir verwenden verschiedene Strategien, um die Zellintegrität von E. coli hoch zu halten. Die Plasmidausbeute übersteigt 1 g/l innerhalb eines Kultivierungszyklus von 30 Stunden. Basierend auf der umfassenden Erfahrung in der mikrobiellen Expression hat Yaohai Bio-Pharma mehrere wirksame Strategien zusammengefasst, um die Zellintegrität von E. coli während der biopharmazeutischen Produktion zu überwachen und zu verbessern.

Techniken zur Überwachung der zellulären Integrität von E. coli

Durchflusszytometrie: Verwendet fluoreszierende Farbstoffe zur Unterscheidung von Zellzuständen, wie etwa Propidiumiodid zur Erkennung der Zelllebensfähigkeit und SYTO9 zur Beurteilung der OM-Durchlässigkeit. Allerdings sind die Farbstoffe teuer und es sind komplexe Verfahren erforderlich.

Kolorimetrische Methoden: Geben Sie die Zelllyse wieder, indem Sie den DNA-Gehalt, die Enzymaktivität usw. im Überstand feststellen, z. B. mithilfe des PicoGreen-Reagenzienkits und alkalischer Phosphataseaktivitätstests. Diese Methoden sind jedoch umständlich und erfordern teure Reagenzien.

Hochleistungsflüssigchromatographie: Wird zur Offline-Erkennung extrazellulärer Produktkonzentrationen verwendet, um OM-Leckagen zu bewerten. Die Automatisierung ist jedoch komplex und die Analysezeit lang.

Techniken der Schwingungsspektroskopie: Wie etwa die Nahinfrarot- und Mittelinfrarotspektroskopie, die über potenzielle Anwendungen verfügen, bei denen jedoch spektrale Interferenzen und Herausforderungen bei der Datenanalyse überwunden werden müssen.

Dielektrische Spektroskopie: Bewertet die Membranintegrität durch Messung der Impedanz von Zellsuspensionen und ermöglicht so eine Online-Überwachung in Echtzeit. Sie ist jedoch störungsanfällig und die Kalibrierung ist schwierig.

Biosensoren: Können aus Zellen oder dem Periplasma ausgetretene Verbindungen erkennen, stehen aber vor Problemen wie Schwierigkeiten bei der Sensorregeneration.

Viskositäts- und Dichtemessungen: Kostengünstig und schnell in der Analyse, jedoch mangelt es an Selektivität und zur Beurteilung müssen Daten mehrerer Chargen berücksichtigt werden.

Faktoren, die die Zellintegrität beeinflussen

Stamm-Engineering: Ändert die OM-Integrität durch genetisches Engineering, beispielsweise durch Mutation von Lipoprotein-Genen, kann aber das Stammwachstum beeinträchtigen.

Induzierter Stress: Die Überexpression rekombinanter Proteine ​​führt zu einer metabolischen Belastung, die die Zellphysiologie beeinträchtigt. Daher ist eine angemessene Regulierung der Expressionsniveaus erforderlich.

Substratzufuhrrate: Sowohl zu hohe als auch zu niedrige Fütterungsraten wirken sich auf die Zelllyse und die OM-Integrität aus.

Temperatur und Belüftung: Hohe Temperaturen und geringe Sauerstoffverfügbarkeit erhöhen den Expressionsstress bzw. den OM-Leck, aber die spezifischen Auswirkungen variieren.

Osmotika: Werden zur Freisetzung periplasmatischer Proteine ​​verwendet, schädigen jedoch die Zelllebensfähigkeit, was ihre Anwendung einschränkt.

Schlussfolgerung Zukünftige Forschung muss tiefer in die Mechanismen und Bedingungen der Membranreparatur eintauchen, um die Integrität der Zellmembran präzise zu kontrollieren. Durch die Optimierung von Überwachungsmethoden und die Analyse von Einflussfaktoren dürfte die Produktqualität verbessert und damit die Entwicklung der biopharmazeutischen Industrie vorangetrieben werden.

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