Optimierung der Zellintegrität von E. coli für die Biopharmaproduktion

Im Bereich der Biopharmazeutika spielt Escherichia coli (E. coli) eine entscheidende Rolle als Wirt für die Expression rekombinanter Proteine. Die Zellintegrität von E. coli ist entscheidend für den Proteinausbeut, die Qualität und die Produktionskosten. Diese Integrität bezieht sich hauptsächlich auf die Struktur und Funktion der Inneren Membran (IM) und der Äußeren Membran (OM).

Yaohai Bio-Pharma hat 15 Jahre Erfahrung in der E. coli-Fermentation und Expression rekombinanter Proteine. Wir verwenden verschiedene Strategien, um eine hohe Zellintegrität von E. coli zu gewährleisten, wobei der Plasmid-Ausbeut überschreitet 1g/L innerhalb eines Kultivierungszyklus von 30 Stunden. Aufbauend auf dem umfangreichen Erfahrung im Bereich der mikrobiellen Expression hat Yaohai Bio-Pharma mehrere effektive Strategien zur Überwachung und Verbesserung der Zellintegrität von E. coli während der Biopharmazeutikaproduktion zusammengefasst.

Techniken zur Überwachung der Zellintegrität von E. coli

Fluoreszenzzytometrie: Verwendet fluoreszierende Farbstoffe, um zelluläre Zustände zu differenzieren, wie Propidiumiodid zur Bestimmung der Zellviabilität und SYTO9 zur Bewertung der OM-Permeabilität. Sie erfordert jedoch hohe Kosten für Färbemittel und komplexe Operationen.

Kolorimetrische Methoden: Spiegeln Zelllyse wider, indem sie den DNS-Gehalt, Enzymaktivitäten usw. im Surnatant nachweisen, wie die Verwendung des PicoGreen-Reagenzkits und Alkaliphosphataseaktivitätstests. Diese Methoden sind jedoch aufwendig und erfordern teure Reagenzien.

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: Wird zur Offline-Ermittlung von extrazellulären Produktkonzentrationen zur Beurteilung des OM-Lecks verwendet. Ihre Automatisierung ist jedoch komplex und die Analysezeit lang.

Schwingungsspektroskopie-Techniken: Wie Nahinfrarot- und Mittelinfrarotspektroskopie, die Anwendungspotential haben, aber spektrale Interferenzen und Datenanalyse-Herausforderungen überwinden müssen.

Dielektrische Spektroskopie: Bewertet die Membranintegrität durch Messung der Impedanz von Zellsuspensionen, was eine Echtzeit-Online-Überwachung ermöglicht. Sie ist jedoch anfällig für Störungen und Kalibrierung ist schwierig.

Biosensoren: Können Verbindungen erkennen, die aus Zellen oder dem Periplasma austritt, haben aber Probleme wie Schwierigkeiten bei der Sensorregeneration.

Viskositäts- und Dichte-Messungen: Niedrig im Preis und schnell in der Analyse, fehlen jedoch an Selektivität und erfordern die Berücksichtigung von Mehrfach-Batch-Daten zur Beurteilung.

Faktoren, die die Zellintegrität beeinflussen

Stammingerieurwesen: Ändert die OM-Integrität durch gentechnische Veränderungen, wie das Mutieren von Lipoproteingenen, kann jedoch das Wachstum des Stammes beeinträchtigen.

Induzierter Stress: Überexpression rekombinanter Proteine führt zu einem metabolischen Belastungsanstieg, was sich auf die zelluläre Physiologie auswirkt. Daher ist eine vernünftige Regulation der Expressionsebenen notwendig.

Substrat-Fütterungsrate: Sowohl zu hohe als auch zu niedrige Fütterungsrate beeinflussen die Zelllyse und die OM-Integrität.

Temperatur und Aeration: Hohe Temperaturen und geringe Sauerstoffverfügbarkeit erhöhen jeweils den Ausdrucksstress und das OM-Leckage, aber die spezifischen Effekte variieren.

Osmotik: Wird verwendet, um periplasmatische Proteine freizusetzen, schädigt aber die Zellviabilität, was ihre Anwendung begrenzt.

Fazit: Zukünftige Forschungen müssen tiefer in die Mechanismen und Bedingungen der Membranreparatur eindringen, um die zelluläre Membranintegrität präzise zu steuern. Die Optimierung von Überwachungsmethoden und die Analyse von Einflussfaktoren sollen die Produktqualität verbessern und damit die Entwicklung der Biopharmaindustrie vorantreiben.

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