IVT-mRNA-Präparation

Die In-vitro-Transkription (IVT) ist die bevorzugte Methode zur Herstellung von mRNA, mit der im Labormaßstab mRNA im Mikrogramm- bis Milligrammbereich hergestellt werden kann. Für Forschungszwecke haben Reagenzienlieferanten vielseitige IVT-Reaktionssysteme entwickelt, die für mRNA mittlerer Länge (1000-4000 Nukleotide) geeignet sind.

In diesem Artikel fassen wir die In-vitro-Transkription (IVT) von mRNA zusammen, einschließlich des herkömmlichen IVT-Reaktionssystems, das im Labormaßstab verwendet wird, und des IVT-Reaktionssystems, das für ultralange mRNA (> 9000 Nukleotide) geeignet ist.

Kits ermöglichen ko-transkriptionelles Capping mit CleanCap AG und reduzieren die Immunogenität mit m1ψ. DNase I entfernt Rest-DNA. Eine geringe Ausbeute kann auf schlechtes Mischen, Reagenzoxidation oder DNA-Vorlagenprobleme zurückzuführen sein, die durch Zentrifugation, frische Reagenzien, Kontrollen und Anpassung der Vorlagenmenge/Reaktionszeit gemildert werden können.

Yaohai Bio-Pharma bietet verschiedene vorgefertigte IVT-RNA-Produkte (flüssiges/gefriergetrocknetes Pulver) und LNP-Fertigprodukte, die Proteine ​​wie fluoreszierende Proteine ​​(eGFP, mCHERRY), Luciferase, Rekombinase Cre und Antigen OVA kodieren, um verschiedene experimentelle oder Projektanforderungen abzudecken.

IVT-System für ultralange mRNA

Bei zu langer mRNA (>9000 nt) funktioniert die konventionelle IVT möglicherweise nicht. Ein tiefes Verständnis und eine rationale Anpassung der IVT-Komponenten sind erforderlich.

DNA-Vorlage: Linearisierte Plasmide oder PCR-Produkte mit entsprechenden Promotorsequenzen, gelöst in RNase-freiem H2O. Für optimale IVT-Bedingungen wird eine DNA-Template-Konzentration von über 40 nM empfohlen.

DVB-T: Erhält die Enzymaktivität während der Transkription aufrecht. Für eine optimale Enzymaktivität sollte dem Reaktionspuffer frisches DTT hinzugefügt werden.

RNase-Inhibitor: Hemmt die RNase-Aktivität und erhält die mRNA-Stabilität.

T7-RNA-Polymerase: Katalysiert die Transkription von DNA in RNA, entsprechend der Promotorsequenz. Die Aktivität der T7-RNA-Polymerase wird durch pH-Wert und Magnesiumionen beeinflusst.

Magnesiumionen (Mg2+): Ein Cofaktor für RNA-Polymerase. Zu niedrige Konzentrationen verringern die Transkriptionseffizienz, während zu hohe Konzentrationen zum RNA-Abbau führen. Freies [Mg2+] sollte basierend auf der Nukleotidkonzentration angepasst werden. Jedes Nukleotid chelatiert ein [Mg2+], daher sollte die [Mg2+]-Konzentration die Gesamtnukleotidkonzentration überschreiten.

Nukleosidtriphosphate (NTP): Als Substrate stellen NTPs die Grundbausteine ​​der RNA dar. NTP-Konzentrationen über 7 mM wirken sich positiv auf die mRNA-Produktion aus.

Spermidin: Stabilisiert DNA-Enzymkomplexe und stimuliert Transkriptionsreaktionen; zu hohe Konzentrationen wirken jedoch hemmend. Die empfohlene Spermidinkonzentration liegt zwischen 1 und 3 mM.

Anorganische Pyrophosphatase (PPase): Wird zu IVT-Reaktionen hinzugefügt, um die Ansammlung anorganischer Pyrophosphat-Ionen (PPi) zu verhindern, ihre Chelatisierung mit Mg2+ zu vermeiden und ausreichend freies Mg2+ sicherzustellen.

Yaohai Bio-Pharma nutzt bahnbrechende Technologie und IVT-mRNA-Erfahrung und bietet einen umfassenden IVT-RNA-Service, der Sequenzdesign, IVT-RNA-Vorbereitung (mit m1ψ-Mods), RNA-Zyklisierung, Reinigung, Gefriertrocknung, LNP-Einkapselung und Qualitätstests umfasst.

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