IVT mRNA-Vorbereitung

Die in vitro Transkription (IVT) ist die bevorzugte Methode zur Vorbereitung von mRNA und kann Mikrogramm bis Milligramm mRNA auf Laboratoriumsskala liefern. Für Forschungszwecke haben Reagenzienlieferanten vielseitige IVT-Reaktionssysteme entwickelt, die für mRNA von moderater Länge (1000-4000 Nukleotide) geeignet sind.

In diesem Artikel werden wir die in vitro Transkription (IVT) von mRNA zusammenfassen, einschließlich des konventionellen IVT-Reaktionssystems, das auf Laboratoriumsskala verwendet wird, und des IVT-Reaktionssystems, das für ultralange mRNA (>9000 Nukleotide) geeignet ist.

Kits ermöglichen die ko-transkriptionelle Verkappung mit CleanCap AG und reduzieren die Immunogenität mit m1ψ. DNase I entfernt residuelles DNA. Ein niedriger Ertrag kann durch unzureichendes Mischen, Reagenzienoxidation oder Probleme mit dem DNA-Vorlagegut verursacht werden, was durch Zentrifugation, frische Reagenzien, Kontrollen und Anpassung der Vorlagegutmenge/Reaktionszeit vermieden werden kann.

Yaohai Bio-Pharma bietet verschiedene vorgefertigte IVT RNA-Produkte (Flüssigkeit/Gefriergetrockneter Pulver) und LNP-Endprodukte an, die Proteine wie Leuchtproteine (eGFP, mCHERRY), Luciferase, Rekombinase Cre und Antigen OVA kodieren, um unterschiedliche experimentelle oder Projektanforderungen zu erfüllen.

IVT-System für ultralanges mRNA

Konventionelles IVT funktioniert möglicherweise nicht für übermäßig langes mRNA (>9000 nt). Ein tiefes Verständnis und eine rationale Anpassung der IVT-Komponenten sind erforderlich.

DNA-Vorlage: Linearisierte Plasmide oder PCR-Produkte mit entsprechenden Promotorsequenzen, in RNase-freiem H2O gelöst. Eine DNA-Vorlagenkonzentration höher als 40 nM wird für optimale IVT-Bedingungen empfohlen.

DTT: Hält die Enzymaktivität während der Transkription aufrecht. Frisches DTT sollte zum Reaktionspuffer hinzugefügt werden, um die optimale Enzymaktivität zu gewährleisten.

RNase-Inhibitor: Hemmt die RNase-Aktivität und hält die mRNA-Stabilität aufrecht.

T7-RNA-Polymerase: Katalysiert die Transkription von DNA in RNA, entsprechend der Promotorsequenz. Die Aktivität der T7 RNA Polymerase wird durch pH und Magnesiumionen beeinflusst.

Magnesiumionen (Mg2+): Ein Kofaktor für die RNA-Polymerase. Zu niedrige Konzentrationen verringern die Transkriptions-effizienz, während zu hohe Konzentrationen zu RNA-Degradation führen. Der freie [Mg2+] sollte auf Basis der Nukleotidkonzentration angepasst werden. Jedes Nukleotid cheliert ein [Mg2+], daher sollte die [Mg2+] Konzentration die Gesamtnukleotidkonzentration überschreiten.

Nukleosidtriphosphate (NTP): Als Substrate sind NTPs die Grundbausteine der RNA. NTP-Konzentrationen über 7 mM haben einen positiven Einfluss auf die mRNA-Produktion.

Spermidin: Stabilisiert DNS-Enzymkomplexe und stimuliert Transkriptionsreaktionen; jedoch haben übermäßige Konzentrationen hemmende Wirkungen. Die empfohlene Spermidinkonzentration liegt zwischen 1 und 3 mM.

Inorganische Pyrophosphatase (PPase): Hinzugefügt zu IVT-Reaktionen, um das Anreicherung von anorganischen Pyrophosphat-Ionen (PPi) zu verhindern, wodurch deren Chelierung mit Mg2+ vermieden und ausreichend freier Mg2+ gesichert wird.

Indem es die bahnbrechende Technologie und die Erfahrung im Bereich IVT mRNA nutzt, bietet Yaohai Bio-Pharma einen kompletten IVT-RNA-Service an, der Sequenzdesign, IVT-RNA-Präparation (mit m1ψ-Modifikationen), RNA-Zyklisierung, Reinhaltung, Tiefkühl-Trocknung, LNP-Einkapselung und Qualitätsprüfung umfasst.

Wir suchen aktiv nach globalen Partnern, sei es Institutionen oder Einzelpersonen. Wir bieten die besten Entschädigungen der Branche. Haben Sie Fragen, zögern Sie nicht, uns zu kontaktieren: [email protected]