Innovative samlingsteknikker til gensyntese i stor skala

Samlingsteknologien til at syntetisere store DNA-fragmenter fra bunden er hjørnestenen i gensyntese, der omfatter metoder som BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson-assembly, CPEC og Overlap PCR. På grund af begrænsningerne af den nuværende teknologi til nøjagtigt at syntetisere DNA af genlængde i et enkelt trin, er det nødvendigt at kombinere in vitro og in vivo samlingsteknikker for at samle oligonukleotidfragmenter syntetiseret i segmenter til lange DNA-fragmenter.

In vitro samlingsteknikker

De er klassificeret i forskellige metoder baseret på fragmentstørrelse og sekvenskarakteristika, med et fælles krav til brug af værktøjsenzymer. Overlap PCR, baseret på DNA-polymerasemetoden, er enkel og hurtig i drift. BioBrick- og BglBrick-metoderne, som er afhængige af isoskizomerer, muliggør standardiseret samling, omend BioBrick-metoden er uegnet til fusionsproteiner. Golden Gate kloningsmetoden, baseret på type IIS restriktionsenzymer, muliggør effektiv sømløs ligering af flere fragmenter. Gibson-samlingsmetoden, som anvender en kombination af flere værktøjsenzymer, muliggør sømløs ligering med fragmentstørrelser, der når flere hundrede kb. Det standardiserede design af DNA-komponenter øger udnyttelsesgraden af ​​eksisterende fragmenter.

In vivo samlingsteknikker

Skønt vitro samlede fragmenter kan nå flere hundrede kb i størrelse, udbyttet er ofte utilstrækkeligt, hvilket nødvendiggør amplifikation ved hjælp af organismer som f.eks. Escherichia coli. Ved samling af fragmenter, der overstiger 20 kb, anvendes ofte rekombinante systemer i organismer, herunder Bacillus subtilis, gær og manipulerede bakterier. Gær er som en almindeligt anvendt vært blevet anerkendt for sin effektive homologe rekombinationsevne i mange år. Det kan bruges til at samle kunstige kromosomer op til flere megabaser (Mb) i længden. Derudover udviser Saccharomyces cerevisiae en ekstraordinær tolerance for kromosomlængde, hvilket giver et teoretisk grundlag for at bruge gær til at konstruere ultralange kromosomer i højere organismer.

Applikationer

Yaohai Bio-Pharma anvender primært to samlingsmetoder til gensyntese: ligasesamling og DNA-polymerasesamling. Ligasesamlingsmetoden forbinder overlappende og hybridiserede 5'-phosphorylerede oligonukleotidfragmenter til dobbeltstrenget DNA ved hjælp af DNA-ligase. Polymerase-samlingsmetoden anvender DNA-polymerase til at udvide de overlappende oligonukleotidfragmenter gennem hybridisering, opnåelse af en blanding af forskellige længder og til sidst amplificere de vellykket samlede fragmenter i fuld længde ved hjælp af primere. Yaohai's kan hjælpe klienter med at opfylde specifikke krav til gensyntese.

Vi søger også aktivt institutionelle eller individuelle globale partnere. Vi tilbyder den mest konkurrencedygtige kompensation i branchen. Hvis du har spørgsmål, er du velkommen til at kontakte os: [email protected]