Per quanto riguarda la preparazione batch dei precursori dell'RNA, un metodo comunemente utilizzato è la trascrizione in vitro (IVT). La reazione IVT utilizza DNA plasmidico linearizzato contenente il promotore T7 come modello e sintetizza un precursore di RNA con nucleosidi trifosfati (NTP) come substrato in presenza della RNA polimerasi T7.
I metodi di ciclizzazione in vitro includono la legatura chimica, la legatura enzimatica e il metodo PIE (introne-esone permutato). La legatura chimica e la legatura enzimatica sono adatte per la ciclizzazione di RNA più corti. Quando il frammento è più grande di 100 nt, la velocità di ciclizzazione diminuirà notevolmente. Al contrario, il metodo nucleasi basato sul sistema PIE può ottenere la ciclizzazione di sequenze da 8 kb.
Sotto la catalisi del guanosina trifosfato (GTP), la struttura PIE subisce ciclizzazione di sequenze extra-introne. In combinazione con una strategia ragionevole per aumentare il tasso di ciclizzazione, Yaohai Bio-Pharma può ottenere sequenze fino a 4 kb, con un'efficienza di ciclizzazione superiore all'80%.
La reazione di ciclizzazione in vitro dell'RNA avviene come segue:
Il precursore dell'RNA viene sintetizzato mediante trascrizione in vitro e il componente PIE completa l'auto-giunzione sotto la catalisi del GTP per formare circRNA.
Dettagli sui servizi
| Processo |
i dettagli del servizio |
Periodo di consegna (giorni lavorativi) |
| Trascrizione e circolazione in vitro |
Conferma del sistema di reazione |
1-2 |
| Reazioni di trascrizione e ciclizzazione in vitro |
| Digestione con RNasi R |
| Ottimizzazione della reazione |
Composizione della reazione, ottimizzazione dei tempi |
2-5 |
Le nostre caratteristiche
- Progettazione e ottimizzazione rigorosa dei test
È possibile ottenere fino a 4 kb di ciclizzazione dell'RNA.
- Elevata efficienza di ciclizzazione
Un tasso di ciclizzazione superiore all'80% può essere raggiunto attraverso una strategia di ottimizzazione della sequenza razionale.
- Controllo rigoroso della RNasi
Attraverso un controllo rigoroso delle RNasi nell'ambiente sperimentale e nei materiali di consumo, la degradazione dell'RNA viene efficacemente prevenuta.
Caso di studio
Ciclizzazione in vitro e arricchimento del circRNA
Basandosi sul sistema PIE, Yaohai Bio-Pharma ha ottimizzato la sequenza del circRNA, con un tasso di ciclizzazione superiore all'80% mediante elettroforesi su gel di agarosio (AGE). Utilizzando RNasi R per arricchire il circRNA, i risultati dell'elettroforesi su gel E mostrano che il precursore lineare dell'RNA viene digerito e, dopo un'ulteriore purificazione, la maggior parte del circRNA intaccato può essere rimosso. La soluzione di purificazione è stata sviluppata autonomamente da Yaohai Bio-Pharma.
Circolazione in vitro e arricchimento del circRNA
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