Riguardo alla preparazione a batch dei precursori di RNA, un metodo comunemente utilizzato è la trascrizione in vitro (IVT). La reazione IVT utilizza DNA plasmidico linearizzato contenente il promotore T7 come template e sintetizza un precursore di RNA con nucleotidi trifosfati (NTPs) come substrato in presenza della polimerasi T7 RNA.
I metodi di ciclizzazione in vitro includono legatura chimica, legatura enzimatica e il metodo permuted introne-esone (PIE). La legatura chimica e quella enzimatica sono adatte per la ciclizzazione di RNAs più corti. Quando il frammento è superiore ai 100 nt, il tasso di ciclizzazione diminuirà notevolmente. Al contrario, il metodo basato sul sistema PIE può raggiungere la ciclizzazione di sequenze fino a 8 kb.
Sotto la catalisi del guanosina trifosfato (GTP), la struttura PIE subisce ciclizzazione delle sequenze extra-introni. Combinata con una strategia ragionevole per aumentare il tasso di ciclizzazione, Yaohai Bio-Pharma può ottenere la ciclizzazione di sequenze fino a 4 kb, con un'efficienza di ciclizzazione superiore al 80%.
La reazione di ciclizzazione in vitro dell'RNA procede come segue:
Il precursore di RNA viene sintetizzato tramite trascrizione in vitro, e il componente PIE completa l'autosplicing sotto la catalisi di GTP per formare circRNA.
Dettagli dei Servizi
| Processo |
Dettagli del servizio |
Periodo di consegna (giornata lavorativa) |
| Trascrizione in vitro e circolazione |
Conferma del sistema di reazione |
1-2 |
| Reazioni di Trascrizione in Vitro e Ciclizzazione |
| Digestione con RNase R |
| Ottimizzazione della reazione |
Composizione della Reazione, Ottimizzazione del Tempo |
2-5 |
Le nostre caratteristiche
- Progettazione e Ottimizzazione dei Test Rigorosi
Si può ottenere la ciclizzazione di fino a 4 kb di RNA.
- Alta efficienza di ciclizzazione
Un tasso di ciclizzazione superiore al 80% può essere raggiunto attraverso una strategia di ottimizzazione sequenziale razionale.
- Controllo rigoroso di RNase
Attraverso un rigoroso controllo delle RNasi nell'ambiente sperimentale e nei consumabili, si preclude efficacemente la degradazione dell'RNA.
Studio di caso
Ciclizzazione e arricchimento in vitro del circRNA
Basandosi sul sistema PIE, Yaohai Bio-Pharma ha ottimizzato la sequenza del circRNA, con un tasso di ciclizzazione superiore al 80% mediante elettroforesi su gel di agarosio (AGE). Utilizzando RNase R per arricchire il circRNA, i risultati dell'elettroforesi E-gel mostrano che il precursore lineare di RNA viene digerito, e dopo ulteriori purificazioni, la maggior parte del circRNA incrinato può essere rimossa. La soluzione di purificazione è stata sviluppata internamente da Yaohai Bio-Pharma.
Circolazione e arricchimento in vitro del circRNA
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