Il capping dell'estremità 5' è una modifica essenziale dell'mRNA. Gli mRNA con strutture cap, in particolare le strutture Cap1, facilitano gli mRNA a eludere le risposte immunitarie innate in vivo, con conseguente traduzione proteica efficiente.
Il capping enzimatico (il metodo in due fasi) è il metodo convenzionale di capping dell'mRNA, simile al processo di capping negli organismi eucariotici. Sotto l'azione di una serie di enzimi, la 7-metilguanina (m7G) è collegata all'estremità 5' dell'mRNA attraverso un legame trifosfato 5'-5' e subisce una modificazione della metilazione per formare la struttura a cappuccio Cap 1 (m7GpppN).
Diagramma della formazione naturale della struttura del cappello
Il flusso della reazione di tappatura enzimatica è il seguente:
Il DNA plasmidico linearizzato viene utilizzato come modello per la trascrizione in vitro (IVT) in presenza della polimerasi T7 e l'mRNA con una struttura terminale 5' viene formato dopo una purificazione in una fase utilizzando l'enzima di copertura vaccinia e 2'-O -metiltransferasi.
Dettagli sui servizi
Servizio opzionale | i dettagli del servizio | Periodo di consegna (giorno) |
Tappatura enzimatica dell'mRNA | Reazione di tappatura enzimatica | 1 |
Ottimizzazione della reazione di tappatura - opzionale | Progettazione e ottimizzazione dei componenti di reazione | 3 ~ 7 |
Le nostre caratteristiche
- Progettazione e ottimizzazione della componente di reazione di tappatura
La componente della reazione di tappatura è ottimizzata e la produzione del trascritto dell'mRNA è notevolmente aumentata.
- Verifica dell'espressione in vitro
L'mRNA bloccato viene trasfettato in cellule 293T ed è possibile rilevare l'espressione della proteina bersaglio.
- Controllo rigoroso della RNasi
Attraverso un controllo rigoroso dell'ambiente sperimentale e dei materiali di consumo di RNaseson, la degradazione dell'mRNA viene efficacemente prevenuta.
Caso di studio
La piattaforma mRNA di Yaohai Bio-Pharma ha creato un perfetto processo di reazione di tappatura.
Per l'mRNA eGFP, un pre-prodotto di mRNA preparato mediante capping enzimatico, è possibile osservare un segnale di fluorescenza eGFP (fluorescenza verde) ad alto livello dopo la trasfezione di cellule 293T per 24 ore, che viene rilevato mediante Western Blot (WB), dimostrando che l'mRNA la proteina fluorescente verde potenziata dalla proteina bersaglio (eGFP) può essere espressa in modo efficiente in vitro.
Espressione dell'mRNA eGFP con cappuccio enzimatico nella cellula 293T
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