Rispetto al capping enzimatico in due fasi, il metodo di capping co-trascrizionale in una fase può ridurre significativamente il flusso del processo. Il metodo è orientato ai risultati e prevede l'aggiunta di analoghi del cappuccio alla reazione di trascrizione in vitro (IVT). Gli analoghi del cappuccio possono essere introdotti all'inizio della trascrizione e l'mRNA con la struttura del cappuccio può essere ottenuto al completamento della trascrizione. Gli attuali analoghi del cap di terza generazione possono evitare il capping inverso e aggiungere direttamente la struttura Cap 1 al prodotto di trascrizione.
Per considerazioni sull'immunogenicità in vivo dell'mRNA e sull'efficienza della traduzione, il processo IVT adotta spesso alcuni tipi di NTP modificati e i nucleotidi modificati comuni sono pseudouridina (Ψ), N1-metil-pseudouri-dina (N1Ψ) e 5-metilcitosina (5mC) .
Figura: diagramma della reazione co-trascrizionale e di copertura dell'mRNA
i dettagli del servizio
Servizi | i dettagli del servizio | Periodo di consegna (giorni lavorativi) |
Tappatura co-trascrizionale | Risposta trascrizionale in vitro (analogo Clean Cap) | 1-2 |
| Modifiche nucleotidiche (Ψ/N1Ψ/5mC) |
| Rimozione del modello di DNA (DNasi I) |
Ottimizzazione delle condizioni IVT - opzionale | Progettazione e ottimizzazione dei componenti di reazione | 3-7 |
Le nostre caratteristiche
- Strategie diversificate di modifica dei nucleotidi
Molteplici strategie opzionali di modifica dei nucleotidi possono migliorare l'espressione proteica.
- Sistema di reazione ottimizzato
Ottieni un rapporto di trascrizione elevato e un'elevata efficienza di capping.
- Processo di tappatura stabile
Raggiungere un tasso di limitazione superiore al 95%.
- Controllo rigoroso della RNasi
Prevenire efficacemente la degradazione dell'mRNA controllando rigorosamente l'RNasi nell'ambiente sperimentale e nei materiali di consumo.
Caso di studio
Yaohai Bio-Pharma ha costruito una piattaforma matura per il processo di tappatura co-trascrizionale, utilizzando analoghi del tappo pulito per aggiungere direttamente la struttura Cap1 evitando la tappatura inversa. Dopo il pretrattamento standardizzato del campione e il rilevamento tramite elettroforesi capillare (CE), il tasso di capping dell'mRNA della proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) può raggiungere oltre il 95%.
Efficienza di capping dell'mRNA eGFP superiore al 95%
L'mRNA eGFP e l'mRNA mCherry preparati mediante capping co-trascrizionale vengono trasfettati rispettivamente in cellule 293T e dopo 48 ore si osserva un forte segnale fluorescente, suggerendo che l'mRNA è espresso in modo efficiente nelle cellule 293T.
Espressione dell'mRNA eGFP e dell'mRNA mCherry nella cellula 293T
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