Riguardo alla produzione di massa di mRNA, la trascrizione in vitro (IVT) è un metodo più efficiente e maturo. La reazione IVT utilizza un plasmide linearizzato contenente il promotore T7 come template, e l'mRNA viene sintetizzato con i trifosfati di nucleosidi (NTPs) come substrati in presenza della polimerasi RNA T7.
La modifica dei nucleotidi è una scoperta fondamentale nell'esplorazione dell'mRNA, dove le molecole d'mRNA non modificate vengono riconosciute dai sensori RNA intracellulari per attivare l'immunità innata. Per considerazioni sull'immunogenicità in vivo dell'mRNA e sull'efficienza di traduzione, il processo IVT utilizza spesso alcuni tipi di NTPs modificati, e i nucleotidi comuni modificati sono pseudouridina (Ψ), N1-metil-pseudouridina (N1Ψ) e citosina-5-metilata (5mC).
Processo di Trascrizione in Vitro dell'mRNA
Diagramma della reazione di trascrizione in vitro (IVT)
Dettagli dei Servizi
Servizio Opzionale |
Dettagli del servizio |
Periodo di consegna (giornata lavorativa) |
Trascrizione in vitro (IVT) |
IVT, Trascrizione in vitro |
1 |
| Modifiche dei nucleotidi (Ψ/N1Ψ/5mC, ecc.) |
| Rimozione del template DNA (DNase I) |
Ottimizzazione delle condizioni IVT - facoltativo |
Progettazione e ottimizzazione dei componenti della reazione IVT |
2-5 |
Le nostre caratteristiche
- Strategie di Modifica Nucleotidica Diversificate
Migliorare la stabilità dell'mRNA e l'espressione proteica in vivo.
- Progettazione e Ottimizzazione dei Test Rigorosi
la preparazione di frammenti mRNA fino a 10kb può essere realizzata.
Ottimizzando le condizioni di reazione IVT, il tasso di trascrizione è fino a 1:200.
- Controllo rigoroso di RNase
Il controllo rigoroso di RNase attraverso un ambiente sperimentale e consumabili può prevenire efficacemente la degradazione dell'mRNA.
Studio di caso
Il sistema di reazione IVT attuale è stato ottimizzato grossomodo per sistemi sintetici con una lunghezza di circa 100 nt, non per mRNA di lunghezza arbitraria. Più lunga è la sequenza di mRNA, più difficile è trascriverla e più è incline alla degradazione.
Al fine di preparare sequenze di mRNA personalizzate con una lunghezza di circa 10 kb, Yaohai Bio-Pharma ha preparato con successo campioni di alta qualità con un alto rapporto di trascrizione di 1:135 e ottenuto 135 μg di prodotti mRNA inizialmente purificati dopo che 1 μg di plasmide linearizzato è stato trascritto in vitro attraverso un progetto sperimentale rigoroso, un'ottimizzazione continua delle condizioni di reazione e un controllo stretto di RNase.
identificazione di mRNA (Elettroforesi su Gel di Agarosio)
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