il cappuccio alla fine 5' è una modifica essenziale dell'mRNA. Gli mRNA con strutture di cappuccio, in particolare le strutture Cap1, facilitano l'evitamento delle risposte immunitarie innate in vivo, risultando in una traduzione proteica efficiente.
Il cappuccio enzimatico (il metodo in due fasi) è il metodo convenzionale per il cappuccio dell'mRNA, simile al processo di cappuccio negli organismi eucarioti. Sotto l'azione di una serie di enzimi, la 7-metilguanina (m7G) viene legata all'estremità 5' dell'mRNA attraverso un legame trifosfato 5'-5' e subisce una modifica di metilazione per formare la struttura di cappuccio Cap1 (m7GpppN).
Diagramma della formazione della struttura naturale del cappuccio
Lo schema della reazione di cappuccio enzimatica è il seguente:
Il DNA plasmidico linearizzato viene utilizzato come template per la trascrizione in vitro (IVT) in presenza della polimerasi T7, e l'mRNA con una struttura di cappuccio all'estremità 5' viene formato dopo una purificazione in un passaggio utilizzando l'enziama di cappuccio della vaccinia e la 2'-O-metiltransferasi.
Dettagli dei Servizi
Servizio Opzionale |
Dettagli del servizio |
Periodo di Consegna (giorni) |
chiusura enzimatica di mRNA |
Reazione di cappatura enzimatica |
1 |
Ottimizzazione della reazione di cappatura - facoltativa |
Progettazione e ottimizzazione dei componenti della reazione |
3~7 |
Le nostre caratteristiche
- Progettazione e ottimizzazione del componente della reazione di cappatura
Il componente della reazione di cappatura è stato ottimizzato, e la produzione del trascritto mRNA è aumentata notevolmente.
- Verifica dell'espressione in vitro
Il mRNA cappato viene trasfettato nelle cellule 293T, e può essere rilevata l'espressione della proteina target.
- Controllo rigoroso di RNase
Attraverso un controllo rigoroso delle RNasi nell'ambiente sperimentale e negli articoli di consumo, si preclude efficacemente la degradazione del mRNA.
Studio di caso
La piattaforma mRNA di Yaohai Bio-Pharma ha sviluppato un processo di reazione di cappatura perfetto.
Per l'mRNA di eGFP, un pre-prodotto mRNA preparato attraverso cappatura enzimatica, dopo aver trasfettato le cellule 293T per 24 ore è possibile osservare un segnale di fluorescenza di eGFP (fluorescenza verde) ad un livello elevato, il quale viene rilevato tramite Western Blot (WB), dimostrando che la proteina target proteina fluorescente verde migliorata (eGFP) può essere espressa in modo efficiente in vitro.
Espressione di mRNA di eGFP Cappato Enzimaticamente nelle Cellule 293T
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