Die Geheimnisse einer hochwertigen Plasmidextraktion entschlüsseln

Die Plasmidextraktion ist für Forscher entscheidend. Als Genvektoren sind Plasmide in der Impfstoffentwicklung und Gentransfertherapie, wo Qualität von Bedeutung ist, von zentraler Bedeutung. Schlüsselfaktoren für die Qualität umfassen den Anteil an supercoiliertem DNA und das Endotoxinhalt. Die Vorschriften variieren: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, mit <5% linear/ offen-kreisförmiges DNA. Kunden bevorzugen oft ≥95% supercoiliert. Endotoxinpegel liegen bei: Forschung (>50 EU/µg), Transfektion (<50 EU/µg) und endotoxinfrei (<0,1 EU/µg).

Supercoiliertes Plasmid-DNA

Plasmide aus Escherichia coli umfassen supercoilierte (SC), offen-kreisförmige (OC) und lineare (L) DNA. Ein hoher SC-Anteil erhöht die Transfektionseffizienz und Expression. Zum Beispiel ist die Transfektion eines 85,45%-SC-Plasmids 2,5-mal höher, und die HGF-Expression eines 93,28%-SC-Plasmids ist 1,8-mal höher, was die Überlegenheit von SC-DNA bestätigt.

Offen-zirkuläres DNA: Wenn eine der beiden Stränge des doppelsträngigen DNS bricht, wird die übergeschlungen Struktur lockerer und bildet ein offen-zirkulares Plasmid mit größerem Volumen, das sich während der Elektrophorese am langsamsten bewegt und oben positioniert ist.

Lineare DNA: Wenn beide Stränge der Plasmid-DNA brechen, entsteht eine lineare Struktur mit relativ kleinerem Volumen, die sich schneller als offen-zirkuläre DNA, aber langsamer als übergeschlungene DNA bewegt und an zweiter Stelle steht.

Übergeschlungene DNA: Zwei Helices verwickeln sich ineinander und bilden eine übergeschlungene Struktur auf Basis der DNS-Helix. Sie hat das kleinste Volumen und wandert während der Elektrophorese am schnellsten, unten positioniert.

Quantitative Analyse des Anteils übergeschlungener DNA

Laboratorien verwenden Agarose-Gel-Elektrophorese (AGE) und Gel-Pro Analyzer, um den Anteil übergeschlungener DNA anhand von Elektrophorese-Bildern zu beurteilen. Ein Bild zeigt 97,539 % SC-DNA, während ein anderes 63,833 % SC und 36,167 % OC-DNA zeigt (lineare DNA nicht sichtbar).

Das Geheimnis von Endotoxinen in Plasmiden

Endotoxin ist ein Bestandteil der äußeren Schicht der Zellwand von gramnegativen Bakterien, das nach bakteriellem Tod oder Lysierung freigesetzt wird und toxisches Lipopolysaccharid A enthält. Während der Plasmidextraktion gelangt Endotoxin in die Lysatlösung, was die Transfektionswirksamkeit beeinflusst und unspezifische Immunreaktionen auslöst, was zu falsch-positiven Ergebnissen in Experimenten führen kann.

Quantitative und qualitative Analyse von Endotoxin

Der Limulus-Amebocyten-Lysat-Test (LAL-Test) erkennt Endotoxin über Agglutination mit 2-Keto-3-deoxyoktansäure (KDO) im Lipopolysaccharid (LPS). Er ist qualitativ und halbquantitativ und zeigt durch Gerinnung oder Farbänderung an, wenn es mit Proben gemischt wird.

Yaohai Bio-Pharma bietet endotoxin-freie supercoilierte Plasmide an. Der Einsatz von Yaohai steigert die Transfektions- und Expressioneffizienz. Gelieferte Plasmide weisen einen ≥95% SC-Anteil (Durchschnitt 85%±10%) und Endotoxinspiegel ≤0,1, ≤0,01 oder ≤0,005 EU/μg auf.

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