Die Geheimnisse der hochwertigen Plasmidextraktion entschlüsseln Deutschland

Die Plasmidextraktion ist für Forscher von entscheidender Bedeutung. Als Genvektoren sind Plasmide in der Impfstoffforschung und Gentherapie von entscheidender Bedeutung, wo Qualität zählt. Zu den wichtigsten Qualitätsfaktoren gehören der Supercoiled-Anteil und der Endotoxingehalt. Die Vorschriften variieren: FDA ≥80 %, SMPA ≥85 %, NMPA ≥90 %, mit <5 % linearer/offen-zirkulärer DNA. Kunden bevorzugen oft ≥95 % Supercoiled. Endotoxinwerte sind: Forschung (>50 EU/µg), Transfektion (<50 EU/µg) und endotoxinfrei (<0.1 EU/µg).

Superspiralisierte Plasmid-DNA

Plasmide von Escherichia coli umfassen supercoiled (SC), open-circular (OC) und lineare (L) DNA. Ein hoher SC-Anteil steigert die Transfektionseffizienz und Expression. Beispielsweise ist die Transfektion eines 85.45 % SC-Plasmids 2.5-mal höher und die HGF-Expression eines 93.28 % SC-Plasmids 1.8-mal höher, was die Überlegenheit von SC-DNA bestätigt.

Offen-zirkuläre DNA: Wenn ein Strang doppelsträngiger DNA bricht, löst sich die superspiralisierte Struktur und es entsteht ein offen-zirkuläres Plasmid mit größerem Volumen, das bei der Elektrophorese am langsamsten wandert und sich oben befindet.

Lineare DNA: Wenn beide Stränge der Plasmid-DNA brechen, bildet sich eine lineare Struktur mit einem relativ kleineren Volumen, das schneller wandert als offen-zirkuläre DNA, aber langsamer als superspiralisierte DNA, die an zweiter Stelle steht.

Superspiralisierte DNA: Zwei Helixe sind miteinander verflochten und verdrehen sich zu einer superspiralisierten Struktur, die auf der DNA-Helix basiert. Sie hat das kleinste Volumen und wandert während der Elektrophorese am schnellsten. Sie befindet sich ganz unten.

Quantitative Analyse des Supercoiled-Anteils

Labore verwenden Agarose-Gelelektrophorese (AGE) und Gel-Pro Analyzer, um den Anteil der Supercoiled-DNA anhand von Elektrophoresebildern zu bestimmen. Ein Bild zeigt 97.539 % SC-DNA, während ein anderes 63.833 % SC- und 36.167 % OC-DNA zeigt (lineare DNA nicht sichtbar).

Das Geheimnis des Endotoxins in Plasmiden

Endotoxin ist ein Bestandteil der äußeren Zellwandschicht gramnegativer Bakterien, der nach dem Absterben oder der Lyse der Bakterien freigesetzt wird und das toxische Lipopolysaccharid A enthält. Bei der Plasmidextraktion gelangt Endotoxin in die Lyselösung, beeinträchtigt die Transfektionseffizienz und löst unspezifische Immunreaktionen aus, was in Experimenten zu falsch positiven Ergebnissen führt.

Quantitative und qualitative Analyse von Endotoxin

Der Limulus-Amöbozytenlysat-Test (LAL) erkennt Endotoxin durch Agglutination mit 2-Keto-3-Desoxyoctonsäure (KDO) im Lipopolysaccharid (LPS). Er ist qualitativ und halbquantitativ und zeigt das Vorhandensein von Endotoxin durch Koagulation oder Farbänderung beim Mischen mit Proben an.

Yaohai Bio-Pharma bietet endotoxinfreie supercoiled Plasmide an. Das Outsourcing an Yaohai steigert die Transfektions- und Expressionseffizienz. Die gelieferten Plasmide haben einen SC-Anteil von ≥95 % (durchschnittlich 85 % ± 10 %) und Endotoxinwerte von ≤0.1, ≤0.01 oder ≤0.005 EU/μg.

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