Die Kraft der Fed-batch Fermentationsstrategie nutzen

Pichia pastoris wird weitgehend in der Produktion verschiedener heterologer Proteine eingesetzt. Die Technologie der Hochzellenstoff-Fermentation (HCDF), die durch Fed-Batch-Ernährung umgesetzt wird, hat erfolgreich die Großskaligerzeugung von Biopharmazeutika und Industrieenzymen erreicht. In genau kontrollierten Medien kann die Nutzung der HCDF-Technologie hochwertige, aktive und kosteneffektive rekombinante Proteine liefern.

Aktuelle Forschungen deuten darauf hin, dass durch HCDF-Strategien Bemühungen unternommen werden, die Produktion und Aktivität heterologer Proteine in Pichia pastoris zu erhöhen. Die HCDF-Technologie ermöglicht es, problemlos hohe Zellkonzentrationen in definierten Medien zu erreichen, wodurch reichlich rekombinante Proteine mit erhöhter Aktivität und reduzierten Kosten durch HCDF gewonnen werden können. Dennoch bleibt die Auswahl der geeigneten HCDF-Strategie zur Optimierung der hohen Expression spezifischer Proteine in Pichia pastoris eine Herausforderung.

Hochzellenstoff-Fermentation (HCDF)

Pichia pastoris zeichnet sich durch die Produktion heterologer Proteine aus und wird für HCDF in automatisierten Bioreaktoren bevorzugt. HCDF hat 3 Phasen: Glycerolbatch, Fütterung und Methanolinduktion. Yaohai Bio-Pharma verfügt über mehr als ein Jahrzehnt an Erfahrung in der mikrobiellen Fermentation und hat bereits über 400 Projekte abgeschlossen. Das Unternehmen besitzt umfangreiches Fachwissen und gut entwickelte Technologien, wodurch es verschiedene HCDF-Strategien einsetzen kann, um die Effizienz der Proteingewinnung zu verbessern.

Methanol dient sowohl als Induktor von AOX1 als auch als Kohlenstoffquelle, seine Konzentration muss jedoch kontrolliert werden, um Toxizität zu vermeiden. Die Bewertung unterschiedlicher Methanol-Fütterungsstrategien ist entscheidend für die Optimierung des Wachstums von Pichia pastoris und der Proteinausdrucksrate.

Methanol-Induktionsstrategie

In der fed-batch HCDF Methanol-Induktionsstrategie umfassen statusbasierte Induktionsstrategien eine Reihe von Regelmethoden, die die nachträgliche Zufuhr von Methanol durch Online/Offline- oder Vorwärts/Rückwärts-Regelung kontrollieren. Unter den statistischen Induktionsstrategien gehören die wichtigsten dazu: μ-stat, Sauerstoffstat (DO)-stat, Methanol-stat und Biomasse-stat.

1.1 μ-stat

die μ-stat Strategie hält die Biomasse durch die Kontrolle von μ konstant, was Reproduzierbarkeit fördert und den Einfluss von μ auf die Proteinausdrucksstudien untersucht. Sie hat jedoch keine direkte Methanol- und DO-Kontrolle, wodurch ein Risiko der Akkumulation und ROS-Entstehung besteht.

1.2 DO-stat

Die DO-Stat-Strategie reguliert den Methanolzufuhr indirekt, indem sie den gelösten Sauerstoff kontrolliert, um die Sauerstoffsättigung aufrechtzuerhalten. Sie fixiert jedoch nicht die Methanol-Konzentration und das Wachstumsrate, was die Untersuchung der Proteinausdrucks beeinflussen kann. Die Sicherstellung ausreichender Sauerstoffversorgung stellt eine Herausforderung in der aeroben Färmentation dar; während die Ergänzung von reinem Sauerstoff kostspielig und toxisch sein kann, bietet Drucksteigerung einen wirtschaftlicheren Ansatz, der auch die Proteaktivität erhöhen kann.

1.3 Methanol-stat

Eine unzureichende Kontrolle der Methanol-Konzentration stellt Einschränkungen sowohl für μ-stat als auch für DO-stat Strategien dar. Methanol-statistische Strategien, die im On/Off-Modus operieren, sind anfällig für Schwankungen und fehlen an Präzision. Im Gegensatz dazu bieten PID-Regler eine genauere Regelung der Methanol-Konzentration, was die Gesamteffizienz der Färmentation erhöht.

1.4 Biomasse-stat

Die Biomass-Stat-Strategie definiert das Verhältnis zwischen Biomasse und Methanolzufuhr, wobei die Methanolzuführungsrate optimiert wird, um den Proteinyield zu erhöhen. Die Online-Überwachung der Biomasse ist praktischer, wobei Flow Cytometrie die bevorzugte Methode ist. Bei einer Skala von 1000L führt die Optimierung der Methanolzuführungsrate zu einer erheblichen Verbesserung der Enzymaktivität, des Yields und der Produktivität, was besser ist als die Reaktorflaschenfermentation.

Ko-Fütterungsstrategie

Glycerin, als AOX1-Promotorhemmer, muss vollständig verbraucht sein, bevor die Methanolinduktion beginnt, um eine Unterdrückung der Proteinsynthese zu vermeiden. Ko-Substrate können die Enzymaktivität erhöhen, aber ein Überschuss an Glycerin kann Wachstum und Expression schaden. Sorbitol, Ascorbinsäure, Mannitol und andere können Glycerin ersetzen, wodurch Proteolyse und Kultivierungszeit reduziert und die Proteinsynthese verbessert wird.

Die Stamm-Bank erfordert die Anwendung angemessener Konservierungsmethoden und Platzierung in einer geeigneten Umgebung, um die Stabilität der Stammcharakteristiken aufrechtzuerhalten. Yaohai Bio-Pharma kann die Anforderungen für Glycerinstockkonservierung (durch ultratiefkühlende Gefriergeräte oder flüssigen Stickstoff) und Trockeneis-Konservierung von Hefen und E. coli erfüllen.

Strategie durch Restriktion

In Pichia pastoris steigern restriktive Bedingungen wie niedriger Sauerstoffgehalt, Methanol-Konzentration und Sauerstofflimitierung die Expression rekombinanter Proteine. Sauerstoff-limitierende Bedingungen aktivieren den AOX1-Promotor über die Ansammlung von Methanol, was die Proteinausbeute erhöht, während es gleichzeitig die Wärmeerzeugung reduziert. Niedrigtemperaturinduktion erhöht die Ausbeute, Aktivität, Stabilität und Zellviabilität, fügt jedoch zusätzliche Kühlkosten hinzu. pH-Wert- und Stickstofflimitierung unterstützen ebenfalls die Expression, wobei Vorsicht geboten ist, um Betriebsprobleme zu vermeiden. Die Stickstofflimitierung hebt insbesondere die spezifische Proteinherausgabe deutlich hervor.

Yaohai Bio-Pharma sucht auch aktiv nach globalen Partnern, sei es institutionell oder individuell, und bietet die wettbewerbsfähigsten Vergütungen der Branche. Wenn Sie Fragen haben, zögern Sie nicht, uns zu kontaktieren: [email protected]