Die Vorteile der Fed-Batch-Fermentationsstrategie nutzen

Pichia pastoris wird häufig zur Herstellung verschiedener heterologer Proteine ​​verwendet. Die High-Cell-Density Fermentation (HCDF)-Technologie, die durch Fed-Batch-Fütterung implementiert wird, hat erfolgreich die Produktion von Biopharmazeutika und industriellen Enzymen im großen Maßstab erreicht. In präzise kontrollierten Medien kann die Verwendung der HCDF-Technologie hochergiebige, hochaktive und kostengünstige rekombinante Proteine ​​liefern.

Aktuelle Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass mithilfe von HCDF-Strategien versucht wird, die Produktion und Aktivität heterologer Proteine ​​in Pichia pastoris zu steigern. Mithilfe der HCDF-Technologie lassen sich mühelos hochgradige Zellcluster in definierten Medien erzeugen, wodurch durch HCDF reichlich rekombinante Proteine ​​mit erhöhter Aktivität und zu geringeren Kosten gewonnen werden können. Die Auswahl der geeigneten HCDF-Strategie zur Optimierung der hochgradigen Expression spezifischer Proteine ​​in Pichia pastoris bleibt jedoch eine Herausforderung.

Hochzelldichtefermentation (HCDF)

Pichia pastoris eignet sich hervorragend für die heterologe Proteinproduktion und wird bevorzugt für HCDF in automatisierten Bioreaktoren eingesetzt. HCDF besteht aus drei Phasen: Glycerin-Batch, Fütterung und Methanol-Induktion. Yaohai Bio-Pharma verfügt über mehr als ein Jahrzehnt Erfahrung in der mikrobiellen Fermentation und hat über 3 Projekte betreut. Das Unternehmen verfügt über umfassendes Fachwissen und eine gut entwickelte Technologie, die es ihm ermöglicht, verschiedene HCDF-Strategien einzusetzen, um die Effizienz der Proteinproduktion zu verbessern.

Methanol dient sowohl als Induktor von AOX1 als auch als Kohlenstoffquelle, seine Konzentration muss jedoch kontrolliert werden, um Toxizität zu vermeiden. Die Bewertung verschiedener Methanol-Fütterungsstrategien ist entscheidend für die Optimierung des Wachstums von Pichia pastoris und der Proteinexpression

Strategie zur Methanol-Induktion

Bei der Fed-Batch-HCDF-Methanol-Induktionsstrategie umfassen zustandsbasierte Induktionsstrategien eine Reihe von Kontrollmethoden, die die zusätzliche Zugabe von Methanol durch Online-/Offline- oder Vorwärts-/Rückwärtssteuerung regeln. Zu den wichtigsten statistischen Induktionsstrategien gehören μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, Methanol-stat und Biomass-stat.

1.1 μ-Stat

Die μ-Stat-Strategie hält die Biomasse stabil, indem sie μ kontrolliert, die Reproduzierbarkeit verbessert und die Wirkung von μ auf die Proteinexpression untersucht. Allerdings fehlt eine direkte Methanol- und DO-Kontrolle, wodurch die Gefahr einer Ansammlung und ROS-Bildung besteht.

1.2 DO-Statistik

Die DO-stat-Strategie reguliert die Methanolzufuhr indirekt, indem sie den gelösten Sauerstoff kontrolliert, um die Sauerstoffversorgung aufrechtzuerhalten, fixiert jedoch nicht die Methanolkonzentration und die Wachstumsrate, was die Untersuchung der Proteinexpression beeinträchtigen kann. Die Sauerstoffversorgung stellt bei der aeroben Fermentation eine Herausforderung dar, und während die Ergänzung von reinem Sauerstoff kostspielig und giftig sein kann, ist die Druckerhöhung ein wirtschaftlicherer Ansatz, der auch die Proteinaktivität steigern kann.

1.3 Methanol-Stat

Eine unzureichende Kontrolle der Methanolkonzentration bringt sowohl für μ-stat- als auch für DO-stat-Strategien Einschränkungen mit sich. Methanol-Statistikstrategien, die im Ein/Aus-Modus arbeiten, sind anfällig für Schwankungen und ungenau. Im Gegensatz dazu bieten PID-Regler eine präzisere Regulierung der Methanolkonzentration und verbessern so die Gesamteffizienz der Fermentation.

1.4 Biomasse-Statistik

Die Biomass-Stat-Strategie definiert die Beziehung zwischen Biomasse und Methanolzufuhr und optimiert die Methanolzufuhrrate, um den Proteinertrag zu steigern. Die Online-Überwachung der Biomasse ist praktischer, wobei die Durchflusszytometrie die bevorzugte Methode ist. Im 1000-Liter-Maßstab verbessert die Optimierung der Methanolzufuhrrate die Enzymaktivität, den Ertrag und die Produktivität erheblich und übertrifft die Kolbenfermentation.

Co-Feeding-Strategie

Glycerin muss als AOX1-Promoter-Inhibitor vor der Methanolinduktion vollständig verbraucht werden, um eine Unterdrückung der Proteinproduktion zu vermeiden. Co-Substrate können die Enzymaktivität steigern, aber überschüssiges Glycerin kann Wachstum und Expression schädigen. Sorbitol, Ascorbinsäure, Mannitol und andere können Glycerin ersetzen, wodurch die Proteolyse und Kultivierungszeit verkürzt und die Proteinexpression gesteigert wird.

Um die Stabilität der Stammeigenschaften zu erhalten, müssen für die Stammbank geeignete Konservierungsmethoden angewendet und die Stämme in einer geeigneten Umgebung untergebracht werden. Yaohai Bio-Pharma kann die Anforderungen für die Konservierung von Glycerinvorräten (mit Ultratiefkühlschränken oder flüssigem Stickstoff) und die Konservierung von Hefe und E. coli durch Gefriertrocknung erfüllen.

Restriktionsinduzierte Strategie

Bei Pichia pastoris fördern restriktive Bedingungen wie niedriger Sauerstoffgehalt, Methanolkonzentration und Sauerstoffbegrenzung die Expression rekombinanter Proteine. Sauerstoffbegrenzte Bedingungen aktivieren den AOX1-Promoter durch Methanolansammlung, wodurch die Proteinproduktion gesteigert und die Hitze reduziert wird. Eine Induktion bei niedrigen Temperaturen verbessert Ertrag, Aktivität, Stabilität und Zelllebensfähigkeit, verursacht jedoch zusätzliche Kühlkosten. pH- und Stickstoffbegrenzung unterstützen die Expression ebenfalls, erfordern jedoch Vorsicht, um Betriebsprobleme zu vermeiden. Stickstoffbegrenzung steigert die spezifische Proteinproduktivität deutlich.

Yaohai Bio-Pharma ist außerdem aktiv auf der Suche nach institutionellen oder individuellen globalen Partnern und bietet die wettbewerbsfähigste Vergütung der Branche. Wenn Sie Fragen haben, können Sie uns gerne kontaktieren: [email protected]