Pokiaľ ide o hromadnú výrobu mRNA, transkripcia in vitro (IVT) je efektívnejšou a zrelší metódou. Reakcia IVT používa linearizovaný plazmidový DNA s T7 promotorom ako šablónu a mRNA sa syntetizuje s nukleozidovými trifosfátami (NTPs) ako substrátmi v prítomnosti T7 RNA polymerázy.
Úprava nukleotidov je prelom v štúdiu mRNA, kde neupravené mRNA molekuly sú rozpoznaté intracelulárnymi senzorami RNA na aktiváciu vrodenej imunity. Z dôvodu imunogennosti mRNA in vivo a účinnosti prekladu sa v procese IVT obvykle používajú určité druhy upravených NTP-ov, a bežne používané upravené nukleotidy sú pseudouridín (Ψ), N1-methyl-pseudouridín (N1Ψ) a 5-methylcytosín (5mC).
Proces in vitro transkripcie mRNA
Schéma reakcie in vitro transkripcie (IVT)
Detaily služieb
Voliteľná služba |
Podrobnosti služby |
Doba dodania (pracovné dni) |
Transkripcia in vitro (IVT) |
IVT, in vitro transkripcia |
1 |
| Úpravy nukleotidov (Ψ/N1Ψ/5mC atď.) |
| Odstránenie DNA šablóny (DNase I) |
Optimalizácia podmienok IVT - voliteľné |
Návrh a optimalizácia komponentov reakcie IVT |
2-5 |
Naše vlastnosti
- Rozmanité stratégie úpravy nukleotidov
Zlepšenie stability mRNA a expresie proteínov in vivo.
- Prísna kontrola návrhu testu a optimalizácia
pриprava fragmentov mRNA až do dĺžky 10kb je možná.
Pomocou optimalizácie podmienok reakcie IVT je rýchlosť preklepania až 1:200.
Prísna kontrola RNase cez experimentálne prostredie a spotrebné materiály môže efektívne predchádzať degradácii mRNA.
Prípadová štúdia<br>
Aktuálny IVT reakčný systém je približne optimalizovaný pre syntetické systémy s dĺžkou asi 100 nt, nie pre mRNA ľubovoľnej dĺžky. Čím je dlhšia sekvencia mRNA, tým je ťažšie ju transkribovať a tým je citlivejšia na degradáciu.
Aby bolo možné pripraviť vlastné mRNA sekvencie s dĺžkou asi 10 kb, spoločnosť Yaohai Bio-Pharma úspešne pripravila vysokokvalitné vzorky s vysokým pomermom transkripcie 1:135 a získala 135 μg počiatočne očistených mRNA produktov po tom, čo bola in vitro transkribovaná 1 μg linearizovaného plazmidu prostredníctvom prísne navrhnutých experimentov, spojitých optimalizácií podmienok reakcie a prísneho kontrolovania RNase.
identifikácia mRNA (Agarózová gelektroforeza)
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
