Yaohai Bio-Pharma lager circRNA basert på PIE-systemet (justering av eksoner og introner), som avhenger av den selvsplicing-funksjonen til type I-introner for å oppnå RNA-sirkulering. PIE-strukturen er designet ved hjelp av T4 td-genen eller fiskets tRNA-forløpergen, og ordningen er som følger:
RNA-intronen og støtteseksongfragmentet deles inn i to deler (5' terminal og 3' terminal), der 5' terminalsekvensen overføres til haleenden av målsekvensen, 3' terminalsekvensen settes foran målsekvensen, og målgenesssekvensen settes inn midt i.
Under katalyse av GTP fører PIE-strukturen til sirkulisering av sekvenser andre enn introner. Kombinert med en rimelig forbedringsstrategi for sirkuliseringshastigheten kan Yaohai Bio-Pharma oppnå sirkulisering av sekvenser på inntil 4 kb med en sirkuliseringshastighet på mer enn 80%.
Figur 1. In vitro-sirkulering av circRNA basert på PIE-systemet
Prosess | Valgfritt tjeneste | Tjenestedytninger | Leveringsperiode (arbeidsdag) |
design og optimalisering av circRNA-sekvenser | Design og optimering av kodesekvenser |
CDS sekvensjustering CDS codon-optimering |
1 |
Design og optimering av ikke-kodende sekvenser |
Design og optimalisering av intron- og exon-sekvenser Design og optimisering av homolog arm-sekvens Design og optimisering av spacer-sekvens |
1-2 |
CircRNA-komponenter | Biologiske funksjoner | Optimeringsstrategier | |
To-terminal intron- og exon-sekvenser | GTP-katalysert intron selv-splicing for sirkulering av sekvenser utenfor intronet. | Designet etter T4 td-genen eller fiskolje tRNA-forløpergenen. | |
Koding | IRES | Intern ribosomgjenkningsside som regulerer oversettelsen av circRNA. | Skjerming av intern ribosominntrangssider (IRES)-sekvenser fra forskjellige viruskilder, f.eks. EMCV, CVB3-kilder. |
CDS | Proteinkodende regioner, sekvenser som koder for antigenner, antistoffer eller andre funksjonelle proteiner. | Kodonoptimalisering øker oversettelsesnivået; visse ikke-optimale kodoner kan spille en rolle i proteinfolding. | |
Ikke-kodende | Ikke-kodende sekvenser | Mål miRNAs eller proteiner for å utøve gen- eller proteinkontroll. | Målspesifikke bindingssteder for miRNAs eller proteiner kan gjenta sekvensene til bindingsstedet. |
Yaohai Bio-Pharma lanserte kontrollproduktet forsterket grønn fluoreserende protein (eGFP) circRNA, som bygger på PIE-systemet for å oppnå sirkulering av RNA.
Ved bruk av et konvensjonelt transfeksjonsmiddel, transfekteres eGFP circRNA i 293T-celler, og eGFP (grønn) fluoreserende signal kan detekteres etter 24 timer, og vil forsterkes etter 48 timer. Fluoreserende signalet kan fortsatt detekteres den 7. og 14. dagen etter transfeksjon.
In vitro uttrykk validering av eGFP circRNA