Oppstrøms prosessutvikling

Mikrobiell CDMO

Betydningen av oppstrøms prosessutvikling

Oppstrømsprosess (USP), også kjent som fermenteringsprosess, er en av de innledende fasene av oppstrøms bioprosessering. Den mikrobielle fermenteringsprosessen er avgjørende for cellekultur med høy tetthet og eksogent genuttrykk, som direkte påvirker det biologiske utbyttet og kostnadene.

I de tidlige stadiene av biologisk utvikling (pre-klinisk eller fase 1/2) er fokuset å utvikle skalerbare dyrefrie prosesser med middels utbytte og oppfylle alle produktkvalitetsstandarder.

Mens vi er i de sene stadiene (fase 3 eller kommersiell), vil vi fokusere på utbytte, robusthet, skalerbarhet og reproduserbarhet, og generere en kostnadseffektiv prosess. Aktivitetene som tar for seg disse problemstillingene er prosesskarakterisering og prosessvalideringsstudier. I mellomtiden brukes verktøy for kvalitet ved design (QbD) og design av eksperimenter (DoE).

Nøkkelord: prosessutvikling, optimalisering og validering, fermenteringsprosess, mikrobiell cellefermentering, bakteriefermentering, gjærfermentering, høydensitetsfermentering, konstruert stammefermentering

Anvendelse: Biofarmasøytisk industri, humanmedisin, dyremedisin, vaksine, rekombinante store molekyler, rekombinante biologiske, biologiske reagenser

USP Solutions of Yaohai Bio-Pharma

Yaohai Bio-Pharma drar nytte av over 10 års erfaring med mikrobiell gjæring, og har ekspertisen til å hjelpe til med å løse utfordringer i gjæringsprosessen. Vi kan raskt etablere gjæringsstrategier med høy tetthet for Escherichia coli (E. coli) periplasmatisk sekresjon, intracellulært løselig eller inklusjonskroppsekspresjon og ekstracellulær eller intracellulær gjærekspresjon.

Våre tilgjengelige generelle gjæringsutviklingstjenester inkluderer:

Fermenteringsprosessdesign utført i liten skala på 7L i fed-batch-modus
Tre-batch prosessvalidering i 7L fermentorer
En mellomprosess skalerer opp til 30L/70L

Vi kan fleksibelt utføre multiparameteroptimalisering for å møte ønsket utbytte eller andel, ved å bruke One-Time-A-Factor (OTAF) eller Design-of-experiments (DoE).

Viktige gjæringsparametere er oppført som følger:

Dyrefrie gjæringsmediesammensetninger

Antibiotikafri eller ikke, inokulumvolum

Veksttemperatur, pH, nivå av oppløst oksygen (DO).

Fôringsmodus (f.eks. matet batch)

Konsentrasjon av induktor (f.eks. IPTG, metanol), induksjonspunkt (cellevåtvekt/OD600),

Induksjonstemperatur, induksjonstid

og så videre

Tjenestedetaljer

Tjenester	Prosessflyt
Dyrking i ristekolbe (500 ml)	Dyrefri mediepreparering → Dyrking av mikrobiell frø → Dyrking i shaker → Induksjon → Høst
Dyrking i Fermenter (7 L)	Dyrefri mediepreparering → Dyrking av mikrobiell frø → Høytetthetscellefermentering i 7L bioreaktor → Induksjon → Høst
Kvalitetskontroll av proteiner/peptider	Forbehandling Intracellulært oppløselig uttrykk: Høsting og resuspensjon av mikrobielle celler → Ultralydknusing → Fjerning av cellerester → Råekstrakt Inklusjonskroppsuttrykk: Mikrobielle celler høstes og resuspensjon → Ultralydknusing → forberedelse av inklusjonskropp → Råekstrakt Ekstracellulært løselig uttrykk: Kultursupernatant og oppsamlingsbuffer bytte → Råekstrakt Kvalitetsanalyse Råekstrakt som prøve → Målproteinanalyse med SDS PAGE eller Western blotting (WB)
Kvalitetskontroll av plasmider	Forbehandling og kvalitetsanalyse Plasmidekstraksjon → DNA-analyse ved agarosegelelektroforese

Case study

Vi har fått i oppdrag av kunden vår å øke målpolypeptidhormonutbyttet fra 8 g/l til 10 g/l.

Basert på Full Factory Design og Response Surface Design i DoE-verktøyene, gjenkjente og optimaliserte vi raskt de viktigste fermenteringsparametrene. Under den optimaliserte fermenteringsprosessen med høy celletetthet økte ekspresjonsnivået til 10 g/L.

Våre erfaringer

Vi har jobbet med ulike typer mikrobielle verter, f.eks. E.coli DH5a, TOP10, Trans10, BL21; Pichia pastoris (P. pastoris) SMD1168H, X-33, GS115, PichiaPink stamme 1/2/3/4; Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) og Hansenula polymorpha (H. polymorpha).
Vi har erfaring med E. coli periplasmatisk sekresjon, løselig og inklusjonskroppsekspresjon, så vel som gjær intracellulært eller ekstracellulært uttrykk. Utbyttet av inklusjonslegemet er opptil 10 g/l, mens utbyttet av løselig protein varierer fra 0.5 til 15 g/l.
Vi har vært involvert i utvikling og produksjon av ulike store molekyler, inkludert rekombinante underenhetsvaksiner, viruslignende partikler (VLP), hormoner (insulin, GLP-1, veksthormon), cytokiner (Interleukin-2/IL-2, IL) -15, IL-21), vekstfaktorer (EGF, FGF, NGF), nanobodies/ enkelt-domene antistoffer (sdAbs), enzymer, etc.
Utstyr

7L*16 gjæringssystem

Cedex Bio Analyzer, Bioprosess analysator

Alle Kategorier

Oppstrøms prosessutvikling

Mikrobiell CDMO