I forhold til den to-trinns enzymatiske lukkingsmetoden kan den ene-trinns ko-transkripsjonelle lukkingsmetoden redusere prosessflyten betydelig. Metoden er resultatorientert og involverer tillegg av cap-analoger til den in vitro transkripsjonsreaksjonen (IVT). Cap-analoger kan introduseres allerede fra starten av transkripsjonen, og mRNA med cap-struktur kan oppnås ved fullføring av transkripsjonen. De nåværende tredjegenerasjons cap-analogene kan unngå omvendt luke og legge til Cap 1-struktur direkte på transkripsjonsproduktet.
Ved å ta hensyn til mRNA sin in vivo immunogenitet og oversettelsesnøyaktighet, bruker IVT-prosessen ofte visse typer modifiserte NTP'er, og vanlige modifiserte nukleotider er pseudouridin (Ψ), N1-metyl-pseudouridin (N1Ψ) og 5-metylcytosin (5mC).
Figur: Diagram over mRNA koh-overskrivnings- og toppingsreaksjon
Tjeneste |
Tjenestedytninger |
Leveringsperiode (arbeidsdag) |
Koh-overskrivningstopping |
In vitro-transkripsjonsrespons (Clean Cap analog) | 1-2 |
Nukleotidmodifikasjoner (Ψ/N1Ψ/5mC) | ||
Fjerne DNA-mal (DNase I) | ||
Optimering av IVT-betingelser - valgfritt |
Design og optimering av reaksjonskomponenter | 3-7 |
Flere valgbare nukleotidmodifiseringsstrategier kan forbedre proteinettrykk.
Oppnå et høyt transkripsjonsforhold og høy dekkningseffektivitet.
Oppnå en dekkningsrate på mer enn 95%.
Forhindre degradasjon av mRNA effektivt ved å kontrollere strengt RNase i eksperimentell miljø og forbruksgoder.
Yaohai Bio-Pharma har bygget opp en moden plattform for samtidig dekkning under transkription, ved å bruke rene dekk-analoger for å legge til Cap1-struktur direkte samtidig som man unngår omvendt dekkning. Etter standardisert prøveforbehandling og kapillær-elektroforese (CE) deteksjon, kan dekkningsraten av den utvidede grønne fluoreserende protein (eGFP) mRNA oppnå mer enn 95%.
dekkings-effektivitet av eGFP mRNA på mer enn 95%
EGFP-mRNA og mCherry-mRNA, som er forberedt ved kofranskripsjonssluting, transfekteres henholdsvis i 293T-celler, og en sterke fluoresentsignal observeres etter 48 timer, noe som tyder på at mRNA-er effektivt uttrykkes i 293T-celler.
Uttrykk av eGFP-mRNA og mCherry-mRNA i 293T-celle