Methoden zur Verbesserung der pDNA-Ausbeute

Die Produktion von Plasmid-DNA (pDNA) beruht auf genetischer Rekombination, bei der das Zielgen und andere Elemente miteinander verbunden werden, um eine kovalent geschlossene ringförmige Struktur zu bilden. Die Fermentation von Escherichia coli und Reinigung sind die wichtigsten Möglichkeiten zur Herstellung von pDNA.

Die Entwicklung der Zell- und Gentherapie (CGT) und mRNA hat mehr Möglichkeiten zur Vorbeugung von Epidemien und zur Behandlung seltener Krankheiten eröffnet. Die industrielle Produktion von CGT und mRNA erfordert hochwertige pDNA. Deshalb optimierte Fermentation von E. coli und hohe Ausbeute an pDNA sind für die Kosteneffizienz von CGT- und mRNA-Impfstoffen/-Medikamenten von entscheidender Bedeutung.

1. Steigende Nachfrage nach pDNA

Laut dem US Plasmid DNA Manufacturing Market Report wird der CGT-Markt voraussichtlich von 7.2 Milliarden USD im Jahr 2023 auf 23.3 Milliarden USD im Jahr 2028 wachsen. Darüber hinaus wird die Gentherapie die dominierende Richtung der CGT werden. Immer mehr CGT-Therapien werden für die Markteinführung zugelassen und immer mehr Pipelines treten in die klinische Phase ein. Infolgedessen steigt die Nachfrage nach pDNA rasant an.

Neben CGT-Therapien ist pDNA ein wesentlicher Rohstoff für die Herstellung von mRNA-Impfstoffen. Mit der kontinuierlichen Innovation der mRNA-Technologie in den Bereichen Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten, Krebsimpfstoffe und Behandlungen seltener Krankheiten wird auch die Nachfrage nach pDNA schnell wachsen.

2. Methoden zur Verbesserung der pDNA-Ausbeute

Angesichts der steigenden Nachfrage nach Plasmid-DNA liegt der Schwerpunkt der aktuellen Technologieentwicklung auf der Optimierung von Fermentationsstrategien zur Verbesserung der pDNA-Ausbeute. Die wichtigsten Bedingungen für die Entwicklung von Upstream-Prozessen umfassen Komponenten des Kulturmediums, Temperatur, pH-Wert, gelösten Sauerstoff (DO), spezifische Produktionsrate und Fed-Batch-Strategien.

Kulturmedium: Das Kulturmedium für die Fermentation von E. coli Bei der Plasmidproduktion wird typischerweise ein halbsynthetisches Medium verwendet. Es besteht aus Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischen Salzen und Spurenelementen. Unter ihnen sind die Arten von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen entscheidend für das Wachstum von E. coli und die Ansammlung von Produkten. Häufig verwendete Kohlenstoffquellen sind Glukose und Glycerin, und Stickstoffquellen umfassen organische und anorganische Stickstoffquellen. Darüber hinaus kann ein zu hohes Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis (C/N) das Wachstum des Bakterienstamms verlangsamen, während ein zu niedriges C/N-Verhältnis zwar schnelles Wachstum fördern, aber die Produktansammlung begrenzen kann.

Temperaturen: Die optimale Temperatur für das Wachstum von E. coli beträgt 37°C. Bei der Batch-Fermentation können jedoch auch niedrigere Temperaturen (30-37°C) verwendet werden, um die maximale spezifische Produktionsrate zu senken und so die Plasmidreplikation zu erhöhen. Bei hitzeempfindlichen Plasmiden kann eine Erhöhung der Temperatur auf 42°C eine Verdoppelung der Plasmidkopienzahl bewirken.

pH: Der optimale pH-Wert für das Wachstum von E. coli beträgt 7±0.2. Der pH-Wert der Fermentationsbrühe wird üblicherweise durch Säure-Base-Pumpen aufrechterhalten.

DO: Der kritische Konzentrationsbereich von gelöstem Sauerstoff für E. coli beträgt 20–30 %. Unzureichender gelöster Sauerstoff kann zu einer übermäßigen Produktion von Essigsäure führen, was das Bakterienwachstum beeinträchtigt und sogar eine bakterielle Autolyse verursacht. Übermäßig gelöster Sauerstoff kann eine Sauerstoffvergiftung verursachen. Zu den Faktoren, die den gelösten Sauerstoff beeinflussen, gehören Rührgeschwindigkeit, Belüftungsrate usw.

Fed-Batch-Strategie: Für die Plasmidproduktion wird häufig die Fed-Batch-Fermentation gewählt. Erstens ist sie förderlich für die Erzielung einer Fermentation mit hoher Zelldichte von E coli, Dies führt zu mehr Biomasse, die als Grundlage für einen hohen Ertrag dient. Zweitens beeinträchtigt das übermäßig schnelle Wachstum von Escherichia coli die Plasmidstabilität. Die Zugabe restriktiver Nährstoffe im Fed-Batch-Verfahren kann die Wachstumsrate von E. coli, wodurch die Plasmidausbeute gesteigert wird. Die DO-stat-Kontrollstrategie wird häufig zur Regulierung des Fed-Batch-Verfahrens während der Plasmidfermentation verwendet. Es gibt auch Forschungsergebnisse, die auf die Durchführbarkeit der pH-stat-Strategie hinweisen.

3. Von Yaohai Bio-Pharma erbrachte Dienstleistungen

Yaohai Bio-Pharma hat eine ausgereifte Plattform für die Plasmidproduktion entwickelt. Darüber hinaus hat Yaohai Bio-Pharma das grundlegende Kulturmedium, das Nährmedium und die Fermentationskontrollstrategie optimiert. Innerhalb eines Kultivierungszyklus von 30 Stunden liegt die Plasmidausbeute bei über 1 g/l.

Darüber hinaus ist Yaohai Bio-Pharma in der Lage, Prozessoptimierungslösungen auf der Grundlage von Einzelfaktor- oder Design of Experiments (DoE)-Methoden für verschiedene Plasmide und Wirtsbakterien bereitzustellen. Yaohai Bio-Pharma ist bestrebt, die Anforderungen der Kunden hinsichtlich hoher Plasmidausbeute und -qualität zu erfüllen.

Yaohai Bio-Pharma ist außerdem aktiv auf der Suche nach institutionellen oder individuellen globalen Partnern und bietet die wettbewerbsfähigste Vergütung der Branche. Bei Fragen wenden Sie sich bitte an: [email protected]