Herstellungsprozess von eGFP-mRNA Deutschland

Die Produktion von eGFP-mRNA (Enhanced Green Fluorescent Protein) umfasst eine Reihe molekularbiologischer Techniken zur Erzeugung eines funktionellen RNA-Moleküls, das die Expression des eGFP kodiert. Im Bereich eGFP-mRNA hat Yaohai Bio-Pharma umfangreiche Erfahrung bei der Erfüllung der spezifischen Anforderungen von Kunden gesammelt. Auf Basis unserer Erfahrung haben wir den Prozessablauf zur Produktion von EGFP-mRNA synthetisiert.

1. Klonen des eGFP-Gens: Es dient dazu, die Gensequenz zu erhalten, die für eGFP kodiert. Dieses Gen wird normalerweise aus einem bereits vorhandenen Plasmidvektor geklont oder auf der Grundlage der bekannten Nukleotidsequenz künstlich synthetisiert. Das geklonte Gen wird dann durch Sequenzierung verifiziert, um die Genauigkeit sicherzustellen.
2. Genoptimierung für die Expression: Für eine optimale Expression im Zielsystem (z. B. Säugetierzellen, Bakterien oder In-vitro-Transkriptionssysteme) kann das eGFP-Gen einer Codon-Optimierung unterzogen werden. Dabei werden seltene Codons in der ursprünglichen Sequenz durch im Wirtsorganismus häufiger verwendete ersetzt, wodurch die Chancen einer effizienten Translation erhöht werden.
3. In vitro Vorbereitung der Transkriptionsvorlage: Sobald das optimierte Gen fertig ist, wird es in einen geeigneten Vektor, häufig ein Plasmid, eingebaut, der die für die Transkription notwendigen regulatorischen Elemente enthält (z. B. eine Promotorsequenz). Dieses Plasmid dient als Vorlage für die In-vitro-Transkription.
4. In vitro Transkription: Unter Verwendung der vorbereiteten Plasmidvorlage wird eine In-vitro-Transkription durchgeführt, um eGFP-mRNA zu synthetisieren. Dieser Prozess beinhaltet die Verwendung von RNA-Polymerase-Enzymen, die die Promotorsequenz erkennen und die Transkription einleiten, wodurch ein komplementärer RNA-Strang zur DNA-Vorlage entsteht. Je nach gewünschter Anwendung kann die mRNA gekappt, polyadenyliert und/oder modifiziert werden, um die Stabilität und Translationseffizienz zu verbessern.
5. Reinigung und Qualitätskontrolle: Die synthetisierte eGFP-mRNA wird dann gereinigt, um alle Verunreinigungen, einschließlich DNA, Proteine ​​und freie Nukleotide, zu entfernen. Reinigungsmethoden können Gelelektrophorese, Säulenchromatographie oder perlenbasierte Trennung umfassen. Nach der Reinigung wird die mRNA auf Qualität, einschließlich Konzentration, Reinheit und Integrität, analysiert, wobei Techniken wie UV-Vis-Spektrophotometrie und Gelelektrophorese zum Einsatz kommen.
6. Lagerung und Lieferung: Die gereinigte eGFP-mRNA wird normalerweise bei niedrigen Temperaturen gelagert, um ihre Stabilität zu erhalten. Für experimentelle Zwecke kann die mRNA je nach Anwendung und Zielzelltyp mithilfe verschiedener Methoden in Zellen eingebracht werden, darunter Elektroporation, Lipofektion oder virale Vektoren.
7. Ausdruck und Verifikation: Sobald die eGFP-mRNA in der Zelle ist, wird sie in das verstärkte grün fluoreszierende Protein übersetzt, das mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden kann. Dadurch kann die erfolgreiche Produktion, Abgabe und Expression von mRNA überprüft werden.

Zusammenfassend umfasst die Produktion von eGFP-mRNA das Klonen des Gens, seine Optimierung für die Expression, die Herstellung einer In-vitro-Transkriptionsvorlage, die Durchführung der Transkriptionsreaktion, die Reinigung der resultierenden mRNA und schließlich die Einbringung in Zellen zur Expression und Verifizierung.

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