Fertigungsprozess von eGFP mRNA

Die Produktion von eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) mRNA umfasst eine Reihe molekularbiologischer Techniken, um ein funktionsfähiges RNA-Molekül zu generieren, das für die Expression von eGFP kodiert. Im Bereich der eGFP mRNA hat Yaohai Bio-Pharma umfangreiche Erfahrung in der Berücksichtigung der spezifischen Bedürfnisse unserer Kunden gesammelt. Durch unsere Erfahrung haben wir den Prozessablauf zur Herstellung von EGFP mRNA zusammengefasst.

1. Klonen des eGFP Gens : Es dient dazu, die Gensequenz zu erhalten, die für eGFP kodiert. Dieses Gen wird normalerweise aus einem vorherigen Plasmidvektor geklont oder künstlich auf Basis der bekannten Nukleotidsequenz synthetisiert. Das geklonte Gen wird dann durch Sequenzierung überprüft, um die Genauigkeit sicherzustellen.
2. Genoptimierung für Expression : Für eine optimale Expression im Zielorganismus (z. B. Säugetierzellen, Bakterien oder in vitro Transkriptionssysteme) kann das eGFP-Gen einer Codonoptimierung unterzogen werden. Dabei werden seltene Codone in der ursprünglichen Sequenz durch häufiger verwendete des Wirtsorganismus ersetzt, was die Wahrscheinlichkeit einer effizienten Translation erhöht.
3. In vitro Vorbereitung des Transkriptionsvorlagen : Sobald das optimierte Gen bereit ist, wird es in einen geeigneten Vektor, oft ein Plasmid, integriert, das regulatorische Elemente für die Transkription enthält (z. B. einen Promotor). Dieses Plasmid dient als Vorlage für die in vitro Transkription.
4. In vitro Transkription : Mithilfe des vorbereiteten Plasmidtemplates wird eine in vitro Transkription durchgeführt, um eGFP mRNA zu synthetisieren. Dieser Prozess erfordert die Verwendung von RNA-Polymerase-Enzymen, die die Promotorsequenz erkennen und die Transkription initiieren, wodurch ein komplementärer RNA-Strang zum DNA-Template produziert wird. Je nach gewünschter Anwendung kann die mRNA mit einem Kap versehen, polyadenyliert und/oder modifiziert werden, um Stabilität und Übersetzungs-effizienz zu verbessern.
5. Reinigung und Qualitätskontrolle : Die synthetisierte eGFP mRNA wird dann gereinigt, um jegliche Verunreinigungen, einschließlich DNA, Proteine und freie Nukleotide zu entfernen. Reinigungsverfahren können Gel-Elektrophorese, Spaltenchromatographie oder perkollbasierte Trennung umfassen. Nach der Reinigung wird die mRNA auf Qualität hin analysiert, einschließlich Konzentration, Reinheit und Integrität, unter Verwendung von Techniken wie UV-Vis-Spektrophotometrie und Gel-Elektrophorese.
6. Lagerung und Zustellung : Das gereinigte eGFP mRNA wird normalerweise bei niedrigen Temperaturen gelagert, um die Stabilität zu gewährleisten. Für experimentelle Zwecke kann die mRNA in Zellen mittels verschiedener Methoden wie Elektroporation, Lipofektion oder viralen Vektoren eingeführt werden, je nach spezifischer Anwendung und Zielzelltyp.
7. Ausdruck und Verifikation : Sobald sie sich im Inneren der Zelle befindet, wird die eGFP mRNA in das erweiterte grüne leuchtende Protein übersetzt, das mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden kann. Dies ermöglicht die Überprüfung des erfolgreichen mRNA-Aufbaus, Transports und Ausdrucks.

Zusammengefasst besteht die Herstellung von eGFP mRNA aus dem Klonen des Gens, dessen Optimierung für den Ausdruck, der Vorbereitung eines in vitro Transkriptionstemplates, der Durchführung der Transkriptionsreaktion, der Reinigung der resultierenden mRNA und schließlich deren Einführung in Zellen für den Ausdruck und die Verifikation.

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