Innovative Montagetechniken für die Großskalensynthese von Genen

Die Assemblietechnologie zur Synthese großer DNA-Fragmente von Grund auf ist der Eckpfeiler der Gensynthese und umfasst Methoden wie BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson-Assemblierung, CPEC und Overlap PCR. Aufgrund der Einschränkungen der aktuellen Technologie bei der genauen Synthese von DNA der Genträgerlänge in einem Schritt ist es notwendig, in vitro- und in vivo-Assemblietechniken zu kombinieren, um oligonukleotidische Fragmente, die segmentiert synthetisiert wurden, zu langen DNA-Fragmenten zusammenzufügen.

In vitro-Assembliertechniken

Sie werden aufgrund der Fragmentgröße und der Sequenzmerkmale in verschiedene Methoden eingeteilt, wobei eine gemeinsame Anforderung die Verwendung von Werkzeug-Enzymen ist. Overlap PCR, das auf der DNA-Polymerase-Methode basiert, ist einfach und schnell in der Durchführung. Die BioBrick- und BglBrick-Methoden, die auf Isoschizomeren basieren, ermöglichen eine standardisierte Assembly, wobei die BioBrick-Methode für Fusionsproteine ungeeignet ist. Die Golden Gate Klonsmethode, die auf Typ IIS Restriktionsenzymen basiert, ermöglicht eine effiziente nahtlose Ligierung mehrerer Fragmente. Die Gibson-Assembly-Methode, die eine Kombination aus mehreren Werkzeugenzymen nutzt, ermöglicht eine nahtlose Ligierung mit Fragmentgrößen von mehreren hundert kb. Die standardisierte Gestaltung von DNA-Komponenten erhöht den Nutzungsgrad bestehender Fragmente.

In-vivo-Assembly-Techniken

Obwohl in vitro können Fragmente erreichen, deren Größe mehrere hundert kb beträgt, jedoch ist die Ausbeute oft unzureichend, was eine Verstärkung mithilfe von Organismen wie Escherichia coli. Beim Zusammenbauen von Fragmenten über 20 kb werden oft rekombinante Systeme innerhalb von Organismen eingesetzt, einschließlich Bacillus subtilis, Hefen und gentechnisch veränderten Bakterien. Hefe wird seit vielen Jahren als gebräuchlicher Wirt anerkannt für ihre effizienten Fähigkeiten zur homologen Rekombination. Sie kann verwendet werden, um künstliche Chromosomen mit einer Länge von mehreren Megabasen (Mb) zusammenzubauen. Darüber hinaus zeigt Saccharomyces cerevisiae eine außergewöhnliche Toleranz gegenüber Chromosomenlänge, was eine theoretische Grundlage für die Nutzung von Hefen bietet, um ultralange Chromosomen in höheren Organismen zu konstruieren.

ANWENDUNGEN

Yaohai Bio-Pharma setzt bei der Gensynthese hauptsächlich zwei Montagemethoden ein: Ligase-Montage und DNA-Polymerase-Montage. Die Ligase-Montagemethode verbindet überlappende und hybridisierte 5'-phosphorylierte Oligonukleotidfragmente zu doppelsträngiger DNA mithilfe von DNA-Ligase. Die Polymerasemethode nutzt DNA-Polymerase, um die überlappenden Oligonukleotidfragmente durch Hybridisierung zu erweitern, wodurch eine Mischung unterschiedlicher Längen entsteht, und amplifiziert schließlich die vollständig zusammengesetzten Fragmente mit Hilfe von Primern. Yaohai kann Kunden bei der Erfüllung spezifischer Anforderungen bei der Gensynthese helfen.

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