Innovative Montagetechniken für die Gensynthese im großen Maßstab Deutschland

Die Assemblierungstechnologie zur Synthese großer DNA-Fragmente von Grund auf ist der Eckpfeiler der Gensynthese und umfasst Methoden wie BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson-Assemblierung, CPEC und Overlap PCR. Aufgrund der Einschränkungen der aktuellen Technologie bei der genauen Synthese von DNA mit Genlänge in einem einzigen Schritt ist es notwendig, In-vitro- und In-vivo-Assemblierungstechniken zu kombinieren, um in Segmenten synthetisierte Oligonukleotidfragmente zu langen DNA-Fragmenten zusammenzusetzen.

In-vitro-Montagetechniken

Sie werden basierend auf Fragmentgröße und Sequenzeigenschaften in verschiedene Methoden eingeteilt, wobei alle Methoden die Verwendung von Hilfsenzymen erfordern. Die auf der DNA-Polymerasemethode basierende Overlap-PCR ist einfach und schnell durchzuführen. Die auf Isoschizomeren basierenden BioBrick- und BglBrick-Methoden ermöglichen eine standardisierte Assemblierung, wobei die BioBrick-Methode jedoch für Fusionsproteine ​​ungeeignet ist. Die Golden Gate-Klonierungsmethode, die auf Restriktionsenzymen vom Typ IIS basiert, ermöglicht die effiziente nahtlose Ligation mehrerer Fragmente. Die Gibson-Assemblierungsmethode, die eine Kombination mehrerer Hilfsenzyme verwendet, ermöglicht eine nahtlose Ligation mit Fragmentgrößen von bis zu mehreren hundert kb. Das standardisierte Design der DNA-Komponenten verbessert die Ausnutzungsrate vorhandener Fragmente.

In-vivo-Montagetechniken

Obwohl in vitro Die zusammengesetzten Fragmente können mehrere hundert kb groß sein, die Ausbeute ist jedoch oft unzureichend, so dass eine Amplifikation mit Organismen wie Escherichia coli. Bei der Zusammenstellung von Fragmenten über 20 kb werden häufig rekombinante Systeme innerhalb von Organismen eingesetzt, darunter Bacillus subtilis, Hefe und gentechnisch veränderte Bakterien. Hefe ist als häufig verwendeter Wirt seit vielen Jahren für seine effiziente Fähigkeit zur homologen Rekombination bekannt. Sie kann zur Zusammenstellung künstlicher Chromosomen mit einer Länge von bis zu mehreren Megabasen (Mb) verwendet werden. Darüber hinaus weist Saccharomyces cerevisiae eine außergewöhnliche Toleranz gegenüber der Chromosomenlänge auf, was eine theoretische Grundlage für die Verwendung von Hefe zur Konstruktion ultralanger Chromosomen in höheren Organismen bietet.

Anwendungen

Yaohai Bio-Pharma verwendet hauptsächlich zwei Assemblierungsmethoden für die Gensynthese: Ligase-Assemblierung und DNA-Polymerase-Assemblierung. Die Ligase-Assemblierungsmethode verbindet überlappende und hybridisierte 5'-phosphorylierte Oligonukleotidfragmente mithilfe von DNA-Ligase zu doppelsträngiger DNA. Die Polymerase-Assemblierungsmethode verwendet DNA-Polymerase, um die überlappenden Oligonukleotidfragmente durch Hybridisierung zu verlängern, wodurch eine Mischung unterschiedlicher Längen entsteht und die erfolgreich assemblierten Fragmente voller Länge schließlich mithilfe von Primern amplifiziert werden. Yaohai kann Kunden dabei helfen, spezifische Anforderungen bei der Gensynthese zu erfüllen.

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