In vergelyking met die twee-stappe enzymatiese kapproses kan die een-stap gelyktydig transkripsiekapproses die prosesstroom beduidend verminder. Die metode is resultaatgerig en behels die byvoeging van kapanalogaats tot die in vitro transkripsie (IVT)-reaksie. Kapanalogaats kan by die begin van transkripsie ingelei word, en mRNA met 'n kapstruktuur kan verkry word wanneer transkripsie voltooi is. Huidige derde-generasie kapanalogaats kan ongekappeerde kaps vermy en direk die Cap 1-struktuur aan die transkripsieprodukt toevoeg.
Voor oorwegings van mRNA in vivo immunogenisiteit en vertalingsdoeltreffendheid word die IVT-proses dikwels gebruik met sekere tipes gemodifiseerde NTP's, en algemene gemodifiseerde nukleotiede is pseudouridine (Ψ), N1-methyl-pseudouridine (N1Ψ) en 5-methylcytosine (5mC).
Figuur: Diagram van mRNA Co-transkripsionele en Kapreaksie
Diens |
Diensbesonderhede |
Leveringstydperk (werkdaag) |
Co-transkripsionele kapping |
In vitro transkripsioneer antwoord (Clean Cap analog) | 1-2 |
Nukleotiedmodifikasies (Ψ/N1Ψ/5mC) | ||
DNA-sjabloon verwydering (DNase I) | ||
IVT-toestandsoptimering - opsioneel |
ReaksiekompONENTontwerp en optimering | 3-7 |
Meerder opsionele nukleotiedmodifikasiestrateë kan eiwituitdruk verbeter.
Verkry 'n hoë transkripsieratio en hoë kappingsdoeltreffendheid.
Verkry 'n kappingskoers van meer as 95%.
Voorkom effektief mRNA-verval deur streng beheer van RNase in die eksperimentele omgewing en verbruiksgoeë.
Yaohai Bio-Pharma het 'n volwasse gelyktydige kappingsprosesplatform opgebou, wat skoon kapanaloga gebruik om direk die Cap1-struktuur toe te voeg terwyl terugwaartse kappings vermy word. Nadat standaard monsters voorbehandeling en kapillêre elektroforesis (CE)-deteksie uitgevoer is, kan die kappingskoers van versterkte groen fluoreserende eiwit (eGFP) mRNA meer as 95% bereik.
eGFP mRNA kappingsdoeltreffendheid van meer as 95%
Die eGFP mRNA en mCherry mRNA wat deur middel van gelyktydige transkripsionele kopving voorberei is, word onderskeidelik in 293T-selle getransfereer, en 'n sterk fluoreserende sein word na 48 ure waargeneem, wat daartoe lei dat die mRNA doeltreffend in 293T-selle uitgedruk word.
Uitdrukking van eGFP mRNA en mCherry mRNA in 293T-selle