mRNA 3' poly(A) Charakterizácia
mRNA 3' poly(A) Charakterizácia
3' poly(A) koniec (polyadenozíny) mRNA je integrálnou súčasťou post-transkripčnej regulácie, pričom ovplyvňuje export, stabilitu a transláciu mRNA. V prípade in vitro transkribovaných (IVT) mRNA je poly(A) koniec zavedený buď počas ko-transkripcie templátovým spôsobom alebo prostredníctvom enzymatického tailingu netemplátovým spôsobom. Tento 3 'poly(A) slúži ako kritický atribút kvality (CQA) pre IVT RNA, čo si vyžaduje dôkladnú charakterizáciu počas vývoja procesu aj uvoľňovania šarží.
Yaohai Bio-Pharma poskytuje špecializované 3' poly(A) charakterizačné služby využívajúce techniky, ako je štiepenie ribonukleázou T1 (RNáza T1), vysokoúčinná kvapalinová chromatografia s reverznou fázou na iónových pároch (IP-RP-HPLC)/kvapalinová chromatografia-hmotnostná spektrometria (LC-MS) a komplexná analýza údajov.
Regulačné požiadavky na charakterizáciu mRNA 3' poly(A).
Podľa regulačných úvah WHO sa „integrita štruktúry mRNA považuje za kritický atribút kvality pre uvoľňovanie mRNA. Preto je potrebná kontrola pre integritu mRNA, účinnosť 5' uzáveru, prítomnosť alebo dĺžku 3' poly(A) chvosta a tak ďalej.
Analytická metóda
Analýza | Metódy |
mRNA 3' poly(A) charakterizácia | LC-MS po strávení |
Postup
Krok 1. Štiepenie RNázou T1
Priama analýza úplnej intaktnej mRNA pomocou LC-MS je nepraktická kvôli jej veľkosti a heterogenite. Na preskúmanie poly(A) chvosta sa musí odštiepiť z mRNA s plnou dĺžkou. Prevládajúca metóda zahŕňa enzymatické štiepenie s RNázou T1, selektívne štiepenie 3' konca rG pri zachovaní poly(A) sekvencie. Vzorka mRNA sa štiepi RNázou T1 a štiepne fragmenty obsahujúce poly(A) úseky sa izolujú s použitím magnetických guľôčok potiahnutých oligo dT.
Krok 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
Extrahované chvosty sa podrobili analýze pomocou LC-MS, ktorá ponúka presné informácie o dĺžke chvosta pri rozlíšení jedného nukleotidu. V oligonukleotidovej LC-MS analýze sú separácie iónovým párovaním s reverznou fázou (IP-RP) s amínovými aditívami mobilnej fázy preferovaným chromatografickým režimom vďaka ich robustnej rozlišovacej schopnosti a kompatibilite s hmotnostnou spektrometriou (MS).
Krok 3. Analýza údajov
Dĺžka poly(A) chvosta a jeho relatívna abundancia závisia od počtu a intenzity píkov delenej hmotnosťou adenozínu. Po spracovaní alebo dekonvolúcii hmotnostného spektra sa rozozná predpokladaná hmotnosť 100-mérneho poly(A) chvosta (33,163 329 Da v rámčeku), sprevádzaná sériou hmotností vzdialených od seba XNUMX amu, čo je ekvivalentné hmotnosti adenozínu (A) .
Prípad 3' poly(A) charakterizácie s LC–MS
Yaohai-BioPharma vyvinula robustnú metódu na charakterizáciu mRNA 3' poly(A), vrátane štiepenia RNázou T1 a IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma vyvinula robustnú metódu na charakterizáciu mRNA 3' poly(A), vrátane štiepenia RNázou T1 a IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
