mRNA 5'capping Efficiency
Význam analýzy účinnosti mRNA 5'capping
Štruktúra uzáveru umiestnená na 5 'konci mRNA hrá kľúčovú úlohu pri účinnej translácii, stabilizácii a transporte mRNA v eukaryotoch. V kontexte in vitro transkribovanej (IVT) mRNA sa 5' čiapočka zavedie buď ko-transkripčným čiapočkou alebo enzymatickou čiapočkou. Ako nepostrádateľná zložka IVT RNA je 5′ uzáver kritickým atribútom kvality (CQA), ktorý si vyžaduje komplexnú charakterizáciu počas vývoja procesu a uvoľnenia šarží.
Yaohai-Bio Pharma poskytuje komplexné riešenia na analýzu účinnosti 5' capping, ktoré zahŕňajú dizajn oligonukleotidových dlahy (sondy), štiepenie RNázou H, IP-RP-iónový pár s reverznou fázou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (IP-RP-HPLC)/kvapalinovej chromatografie -hmotnostná spektrometria (LC-MS), analýza údajov.
Regulačné požiadavky na integritu mRNA
Podľa regulačných úvah WHO sa „integrita štruktúry mRNA považuje za kritický atribút kvality pre uvoľňovanie mRNA. Preto je potrebná kontrola pre integritu mRNA, účinnosť 5' uzáveru, prítomnosť alebo dĺžku 3' poly(A) chvosta a tak ďalej.
Analytická metóda
Analýza |
Metódy |
mRNA 5'capping Efficiency |
LC-MS po strávení |
Postup
Krok 1. Návrh oligonukleotidových dlahy (sondy).
Štiepiaca sonda, obsahujúca 2'-XNUMX-metylnukleotidy a tetradeoxyribonukleotidy, slúži na štiepenie komplementárneho vlákna RNA v špecifických polohách, keď je prítomná RNáza H. Táto metóda sa ukazuje ako vysoko hodnotná pre cielenú tvorbu väčších fragmentov RNA.
Krok 2. Štiepenie RNázy H
Biotinylovaná sonda, strategicky navrhnutá tak, aby bola komplementárna k 5' koncu mRNA, sa aplikuje v spojení s RNázou H, aby katalyzovala cielené štiepenie 5' koncového oligonukleotidu, ktorý má štruktúru uzáveru.
Krok 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
Pri oligonukleotidovej LC-MS analýze je preferovaným chromatografickým režimom separácia s reverznou fázou s párovaním iónov (IP-RP) s použitím amínových aditív mobilnej fázy. To sa pripisuje ich vynikajúcej rozlišovacej schopnosti a kompatibilite s hmotnostnou spektrometriou (MS).
Krok 4. Analýza dát
Odlišné hmotnosti pozorované vo fragmentoch štiepenia s čiapočkou m7GpppG, na rozdiel od tých s difosfátom, trifosfátom alebo nemetylovaným uzáverom G (GpppG), uľahčujú ich identifikáciu a umožňujú odhad účinnosti uzáveru.
Prípad analýzy účinnosti uzáveru pomocou LC–MS
Spoločnosť Yaohai-Bio Pharma vyvinula robustné metódy na analýzu účinnosti uzatvárania mRNA, od návrhu oligonukleotidových dlahy (sondy), štiepenia RNázou H, IP-RP-HPLC/LC-MS až po analýzu údajov.
Celkové iónové chromatogramy (vľavo) a elektrosprejové hmotnostné spektrá (vpravo) 5'koncových štiepnych fragmentov
EN
