Caracterizarea ARNm 3' poli(A).
Caracterizarea ARNm 3' poli(A).
Coada 3' poli(A) (poliadenozine) a ARNm este parte integrantă a reglării post-transcripționale, influențând exportul, stabilitatea și translația ARNm. În cazul ARNm-urilor transcrise in vitro (IVT), coada poli(A) este introdusă fie în timpul co-transcripției într-o manieră șablonă, fie printr-un proces de coadă enzimatic într-o manieră fără șablon. Acest 3′ poli(A) servește ca atribut critic de calitate (CQA) pentru ARN IVT, necesitând o caracterizare amănunțită atât în timpul dezvoltării procesului, cât și al eliberării lotului.
Yaohai Bio-Pharma furnizează servicii specializate de caracterizare 3' poli(A), utilizând tehnici precum scindarea ribonucleazei T1 (RNază T1), cromatografia lichidă de înaltă performanță în fază inversă cu perechi de ioni (IP-RP-HPLC)/cromatografia lichidă-spectrometrie de masă (LC-MS) și analiză cuprinzătoare a datelor.
Cerințe de reglementare pentru caracterizarea ARNm 3' poli(A).
Conform considerațiilor de reglementare ale OMS, „integritatea structurii ARNm este considerată a fi un atribut de calitate critic pentru eliberarea ARNm. Astfel, este necesar controlul pentru integritatea ARNm, eficiența plafonării 5′, prezența sau lungimea cozii 3′ poli(A) și așa mai departe.”
Metoda analitică
Analiză |
Metode |
Caracterizarea ARNm 3' poli(A). |
LC-MS după digestie |
Procedură
Pasul 1. Scindarea RNază T1
Analiza directă a ARNm intact de lungime completă prin LC-MS este nepractică datorită dimensiunii și eterogenității sale. Pentru a examina coada poli(A), aceasta trebuie scindată din ARNm de lungime completă. Metoda predominantă implică digestia enzimatică cu RNază T1, scindarea selectivă a capătului 3′ al rG, păstrând în același timp secvența poli(A). Proba de ARNm este supusă digestiei cu RNază T1, iar fragmentele de clivaj care conțin întinderi poli(A) sunt izolate folosind perle magnetice acoperite cu oligo dT.
Pasul 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
Cozile extrase au fost analizate folosind LC-MS, oferind informații precise despre lungimea cozii la rezoluție cu o singură nucleotidă. În analiza oligonucleotidelor LC-MS, separările în fază inversă cu împerechere de ioni (IP-RP) cu aditivi în fază mobilă amină reprezintă modul cromatografic preferat, datorită puterii lor de rezoluție robuste și compatibilității cu spectrometria de masă (MS).
Pasul 3. Analiza datelor
Lungimea cozii poli(A) și abundența sa relativă depind de numărul și intensitatea vârfurilor împărțite la o masă de adenozină. La procesarea sau deconvoluția spectrului de masă, se descoperă masa anticipată a unei cozi de poli(A) de 100 de meri (33,163 Da în cutie), însoțită de o serie de mase distanțate la 329 amu, echivalent cu masa adenozinei (A) .
Caz de caracterizare 3' poli(A) cu LC–MS
Yaohai-BioPharma a dezvoltat o metodă robustă pentru caracterizarea ARNm 3' poli(A), inclusiv scindarea RNază T1 și IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma a dezvoltat o metodă robustă pentru caracterizarea ARNm 3' poli(A), inclusiv scindarea RNază T1 și IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
