În ceea ce privește prepararea lotului de precursori de ARN, o metodă frecvent utilizată este transcripția in vitro (IVT). Reacția IVT folosește ADN plasmid liniarizat care conține promotorul T7 ca șablon și sintetizează un precursor de ARN cu trifosfați nucleozidici (NTP) ca substrat în prezența ARN polimerazei T7.
Metodele de ciclizare in vitro includ ligatura chimică, ligatura enzimatică și metoda intron-exon permutat (PIE). Ligarea chimică și ligarea enzimatică sunt potrivite pentru ciclizarea ARN-urilor mai scurte. Când fragmentul este mai mare de 100 nt, rata de ciclizare va scădea foarte mult. În schimb, metoda nucleazei bazată pe sistemul PIE poate realiza ciclizarea secvențelor de 8 kb.
Sub cataliza trifosfatului de guanozină (GTP), structura PIE suferă ciclizarea secvențelor extra-intronului. Combinat cu o strategie rezonabilă de creștere a ratei de ciclizare, Yaohai Bio-Pharma poate realiza ciclizare de până la 4 kb secvențe, cu o eficiență de ciclizare de peste 80%.
Reacția de ciclizare in vitro a ARN-ului curge după cum urmează:
Precursorul ARN este sintetizat prin transcripție in vitro, iar componenta PIE completează auto-splicing sub cataliza GTP pentru a forma circARN.
Detalii despre servicii
| Proces | Detalii despre servicii | Perioada de livrare (zi lucrătoare) |
| Transcriere și circulație in vitro | Confirmarea sistemului de reacție | 1-2 |
| Reacții de transcripție și ciclizare in vitro |
| Digestia RNază R |
| Optimizarea reactiei | Compoziția reacției, optimizarea timpului | 2-5 |
Caracteristicile noastre
- Proiectare și optimizare riguroasă a testelor
Se pot realiza până la 4 kb de ciclizare a ARN.
- Eficiență mare de ciclizare
O rată de ciclizare de peste 80% poate fi atinsă printr-o strategie rațională de optimizare a secvenței.
Prin controlul strict al RNazelor în mediul experimental și consumabile, degradarea ARN este prevenită în mod eficient.
Studiu de caz
Ciclizarea in vitro și îmbogățirea circARN
Pe baza sistemului PIE, Yaohai Bio-Pharma a optimizat secvența circARN, cu o rată de ciclizare de peste 80% prin electroforeză pe gel de agaroză (AGE). Folosind RNază R pentru a îmbogăți ARN-ul circular, rezultatele electroforezei E-gel arată că precursorul ARN-ului liniar este digerat și, după purificare ulterioară, cea mai mare parte a ARN-ului ciupit poate fi îndepărtată. Soluția de purificare este auto-dezvoltată de Yaohai Bio-Pharma.
Circulația in vitro și îmbogățirea circRNA
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NU
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
