Eficiența de acoperire 5'mARN
Semnificația analizei eficienței de limitare a mRNA 5'
Structura capacului situată la capătul 5′ al ARNm joacă un rol esențial în traducerea, stabilizarea și transportul eficient al ARNm în interiorul eucariotelor. În contextul ARNm transcris in vitro (IVT), capacul 5’ este introdus fie prin procese de acoperire co-transcripțională, fie prin procese de acoperire enzimatică. Ca o componentă indispensabilă a ARN-urilor IVT, capacul 5′ reprezintă un atribut critic de calitate (CQA) care necesită o caracterizare cuprinzătoare pe parcursul dezvoltării procesului și eliberării lotului.
Yaohai-Bio Pharma oferă soluții cuprinzătoare de analiză a eficienței plafonării de 5’, cuprinzând design de atele (sondă) de oligonucleotide, scindarea RNază H, cromatografie lichidă de înaltă performanță cu fază inversă (IP-RP-HPLC)/cromatografie lichidă IP-RP-Ion-pereche. -spectrometrie de masă (LC-MS), analiza datelor.
Cerințe de reglementare pentru integritatea ARNm
Conform considerațiilor de reglementare ale OMS, „integritatea structurii ARNm este considerată a fi un atribut de calitate critic pentru eliberarea ARNm. Astfel, este necesar controlul pentru integritatea ARNm, eficiența plafonării 5′, prezența sau lungimea cozii 3′ poli(A) și așa mai departe.”
Metoda analitică
Analiză |
Metode |
ARNm 5' eficiență de acoperire |
LC-MS după digestie |
Procedură
Pasul 1. Proiectare atele (sondă) de oligonucleotide
Sonda de scindare, care încorporează 2’-O-metilnucleotide și tetradeoxiribonucleotide, servește la scindarea unei catene de ARN complementare în poziții specifice când RNaza H este prezentă. Această metodă se dovedește foarte valoroasă pentru generarea țintită a fragmentelor de ARN mai mari.
Etapa 2. Scindarea RNază H
O sondă biotinilată, proiectată strategic pentru a fi complementară capătului 5' al ARNm, este aplicată împreună cu RNaza H pentru a cataliza scindarea ţintită a oligonucleotidei de capăt 5' care posedă o structură de capac.
Pasul 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
În analiza LC-MS a oligonucleotidelor, modul cromatografic preferat este separările în fază inversă cu împerechere de ioni (IP-RP) utilizând aditivi în fază mobilă de amină. Acest lucru este atribuit puterii lor superioare de rezoluție și compatibilității cu spectrometria de masă (MS).
Pasul 4. Analiza datelor
Masele distincte observate în fragmentele de clivaj care prezintă un capac m7GpppG, spre deosebire de cele cu un capac difosfat, trifosfat sau G nemetilat (GpppG), facilitează identificarea acestora și permit estimarea eficienței plafonării.
Cazul analizei eficienței plafonării cu LC–MS
Yaohai-Bio Pharma a dezvoltat metode robuste pentru analiza eficienței plafonării ARNm, de la proiectarea atelelor oligonucleotidice (sondă), scindarea RNază H, IP-RP-HPLC/LC-MS până la analiza datelor.
Cromatogramele cu ioni totali (stânga) și spectrele de masă cu electrospray (dreapta) ale fragmentelor de clivaj la capătul 5'
EN
