Iskorištavanje moći strategije fermentacije Fed-batch

Pichia pastoris se široko koristi u proizvodnji različitih heteroloških proteina. Tehnologija visoke gustoće stanica (High-Cell-Density Fermentation - HCDF), implementirana kroz Fed-Batch dojenje, uspješno je postigla veliku proizvodnju biofarmaceutsaka i industrijskih enzima. U precizno kontroliranom sredstvu, uporaba HCDF tehnologije može rezultirati visokim otkazom, visokom aktivnosti i ekonomičnim rekombinantnim proteinima.

Nedavna istraživanja ukazuju da se pomoću HCDF strategija radi na povećanju proizvodnje i aktivnosti heteroloških proteina u Pichia pastoris. HCDF tehnologija omogućuje lako dostizanje visokog nivoa klastera stanica u definiranom sredstvu, čime omogućuje dobivanje obilnih rekombinantnih proteina s poboljšanom aktivnostiš i smanjenim troškovima putem HCDF. Međutim, izbor odgovarajuće HCDF strategije za optimizaciju visoke izražavanosti specifičnih proteina u Pichia pastoris ostaje izazov.

High-Cell-Density Fermentation (HCDF)

Pichia pastoris iznijema se u proizvodnji heteroloških proteina, pri čemu je posebno omiljena za HCDF u automatiziranim bioreaktorima. HCDF ima 3 faze: glycerolovu fazu, hranićnu i indukciju metanolom. Yaohai Bio-Pharma raspolazi više od desetljećem iskustva u mikrobijskoj fermentaciji i služila je preko 400 projekata. Tvrtka posjeduje obsežno znanje i dobro razvijenu tehnologiju, što joj omogućava upotrebu različitih HCDF strategija kako bi se poboljšala učinkovitost proizvodnje proteina.

Metanol služi kao induktor AOX1 i kao izvor ugljika, ali njegova koncentracija mora biti kontrolirana kako ne bi došlo do toksičnosti. Vrednovanje različitih strategija davanja metanolu ključno je za optimizaciju rasta Pichia pastoris i izražavanja proteina.

Strategija indukcije metanolom

U strategiji indukcije metanolom s HCDF ukrštanim hrmanjem, stanjske strategije indukcije obuhvaćaju skup metoda upravljanja koje reguliraju dodatnu dodavanju metanol preko upravljanja online/offline ili naprijed/natrag. Među statističkim strategijama indukcije, glavne uključuju μ-stat, stat disocijiranog kisika (DO)-stat, metanol-stat i biomasa-stat.

1.1 μ-stat

μ-stat strategija održava biomassu stalnom kontroliranjem μ, što pomaže u reprodukciji i proučavanju utjecaja μ na izraz proteina. Međutim, nedostaje joj direktna kontrola metanol i DO, što nosi rizik akumulacije i generiranja ROS-a.

1.2 DO-stat

D-O stat strategija indirektno regulira davanje metanolja kontroliranjem disolviranog kisika kako bi se održao oksigenacijon, ali ne utvrđuje koncentraciju metanolja i brzinu rasta, što može utjecati na proučavanje izražavanja proteina. Oksigenacija stavlja izazov u aerobnoj fermentaciji, a iako dopunjavanje čistim kisikom može biti skupo i toksično, povećanje tlaka je ekonomičniji pristup koji također može poboljšati aktivnost proteina.

1.3 Methanol-stat

Nedostatna kontrola koncentracije metanolja stavlja ograničenja na oba μ-stat i DO-stat strategije. Metanol statističke strategije koje rade u na/off režimu podložne su fluktuacijama i nedostaju preciznosti. U protivnome, PID kontroleri nude precizniju regulaciju koncentracije metanolja, što poboljšava učinkovitost fermentacije.

1.4 Biomasa-stat

Strategija biomass-stat definira odnos između biomase i davanja metanol, optimizirajući brzinu davanja metanol-a kako bi se povećao nakup proteina. Online praćenje biomase je praktičnije, a metoda izbora je cijevna citometrija. Na razini od 1000L, optimizacija brzine davanja metanol-a znatno poboljšava aktivnost enzima, nakup i produktivnost, premašujući flasčnu fermentaciju.

Kovaranjska strategija

Glicerol, kao inhibitor promotor AOX1, mora biti potpuno iskorišten prije indukcije metanolom kako bi se spriječilo prigušivanje proizvodnje proteina. Kovaralice mogu poboljšati aktivnost enzima, ali su višak glicerola štetan za rast i izraz. Sorbitol, askorbinska kiselina, manitol i drugi mogu zamijeniti glicerol, smanjujući proteolizu i vrijeme kultiviranja te poboljšavajući izraz proteina.

Banka štrana zahtjeva usvajanje odgovarajućih metoda očuvanja i smještaj u odgovarajućej okolini kako bi se održao stabilnost karakteristika štrana. Yaohai Bio-Pharma može ispuniti zahteve za čuvanjem gliserolovog zaliha (pomoću hladnjaka s ultra-niskom temperaturom ili tekućim azotom) i sušenjem na mrazu za čuvanje kvasaca i E. coli.

Strategija uzrokovana ograničenjem

U Pichia pastoris, ograničujuće uvjete poput niske DO, koncentracije metanolova i ograničenja kisika poboljšavaju izraz rekombinantnih proteina. Ograničenja kisika aktiviraju promotor AOX1 putem akumulacije metanolova, povećavajući izlaz proteina dok smanjuju toplinu. Indukcija na niskoj temperaturi poboljšava dobiv, aktivnost, stabilnost i životnu sposobnost stanica, ali dodatno stvara troškove hlađenja. Ograničenja pH-a i azota također podržavaju izraz, s potrebnom pažnjom da se izbjegne operativna komplikacija. Ograničenje azota znatno poboljšava specifičnu produktivnost proteina.

Yaohai Bio-Pharma također aktivno traži globalne partnerе, institucionalne ili pojedinačne, i nudi najkonkurentniju kompenzaciju u industriji. Ako imate bilo kakva pitanja, slobodno nas kontaktirajte: [email protected]