Iskorištavanje snage strategije šaržne fermentacije Hrvatska

Pichia pastoris ima široku primjenu u proizvodnji različitih heterolognih proteina. Tehnologija fermentacije visoke gustoće stanica (HCDF), implementirana kroz Fed-Batch hranjenje, uspješno je postigla veliku proizvodnju biofarmaceutika i industrijskih enzima. U precizno kontroliranim medijima, upotrebom HCDF tehnologije mogu se dobiti rekombinantni proteini visokog prinosa, visoke aktivnosti i isplativi.

Nedavna istraživanja pokazuju da se kroz HCDF strategije ulažu napori da se poveća proizvodnja i aktivnost heterolognih proteina u Pichia pastoris. HCDF tehnologija omogućuje postizanje klastera stanica na visokoj razini bez napora u definiranim medijima, čime se omogućuje stjecanje obilja rekombinantnih proteina s poboljšanom aktivnošću i smanjenim troškovima putem HCDF-a. Međutim, odabir odgovarajuće strategije HCDF-a za optimizaciju visoke razine ekspresije specifičnih proteina u Pichii pastoris ostaje izazov.

Fermentacija visoke gustoće stanica (HCDF)

Pichia pastoris ističe se u heterolognoj proizvodnji proteina, favoriziranoj za HCDF u automatiziranim bioreaktorima. HCDF ima 3 faze: šarža glicerola, hranjenje i indukcija metanolom. Yaohai Bio-Pharma može se pohvaliti više od desetljeća iskustva u mikrobnoj fermentaciji i poslužila je preko 400 projekata. Tvrtka posjeduje opsežnu stručnost i dobro razvijenu tehnologiju, što joj omogućuje korištenje različitih HCDF strategija za poboljšanje učinkovitosti proizvodnje proteina.

Metanol služi i kao induktor AOX1 i kao izvor ugljika, ali njegova se koncentracija mora kontrolirati kako bi se spriječila toksičnost. Procjena različitih strategija hranjenja metanolom ključna je za optimiziranje rasta Pichia pastoris i ekspresije proteina

Strategija indukcije metanola

U strategiji indukcije HCDF metanola šarže s napajanjem, strategije indukcije temeljene na stanju obuhvaćaju skup kontrolnih metodologija koje reguliraju dodatno dodavanje metanola putem online/offline ili naprijed/natrag kontrole. Među strategijama statističke indukcije, glavne uključuju μ-stat, Otopljeni kisik (DO)-stat, metanol-stat i biomasa-stat.

1.1 μ-stat

μ-stat strategija održava biomasu stabilnom kontrolirajući μ, pomažući ponovljivost i proučavajući učinak μ na ekspresiju proteina. Međutim, nedostaje mu izravna kontrola metanola i DO, čime postoji opasnost od nakupljanja i stvaranja ROS-a.

1.2 DO-stat

DO-stat strategija neizravno regulira unos metanola kontroliranjem otopljenog kisika kako bi se održala oksigenacija, ali ne utvrđuje koncentraciju metanola i stopu rasta, što može utjecati na proučavanje ekspresije proteina. Oksigenacija predstavlja izazov u aerobnoj fermentaciji, i dok dodatak čistog kisika može biti skup i otrovan, povećanje tlaka je ekonomičniji pristup koji također može povećati aktivnost proteina.

1.3 Metanol-stat

Neadekvatna kontrola koncentracije metanola predstavlja ograničenja i za μ-stat i za DO-stat strategije. Statističke strategije za metanol, koje rade u načinu uključivanja/isključivanja, sklone su fluktuacijama i nedovoljno su precizne. Nasuprot tome, PID regulatori nude precizniju regulaciju koncentracije metanola, povećavajući ukupnu učinkovitost fermentacije.

1.4 Statistika biomase

Strategija statistike biomase definira odnos između biomase i unosa metanola, optimizirajući brzinu unosa metanola za povećanje prinosa proteina. Online praćenje biomase je praktičnije, a protočna citometrija je preferirana metoda. Na ljestvici od 1000 L, optimiziranje brzine punjenja metanolom značajno poboljšava aktivnost enzima, prinos i produktivnost, nadmašujući fermentaciju u tikvici.

Strategija zajedničkog hranjenja

Glicerol, kao inhibitor promotora AOX1, mora se u potpunosti potrošiti prije indukcije metanolom kako bi se izbjegla supresija proizvodnje proteina. Kosupstrati mogu pojačati aktivnost enzima, ali višak glicerola može oštetiti rast i ekspresiju. Sorbitol, askorbinska kiselina, manitol i drugi mogu zamijeniti glicerol, smanjujući vrijeme proteolize i kultivacije te povećavajući ekspresiju proteina.

Banka sojeva zahtijeva usvajanje odgovarajućih metoda očuvanja i smještaj u prikladno okruženje kako bi se održala stabilnost karakteristika soja. Yaohai Bio-Pharma može ispuniti zahtjeve za očuvanje zalihe glicerola (putem zamrzivača na ultra niskoj temperaturi ili tekućeg dušika) i konzerviranje sušenjem zamrzavanjem kvasca i E. coli.

Strategija izazvana ograničenjima

U Pichia pastoris, restriktivni uvjeti poput niskog DO, koncentracije metanola i ograničenja kisika potiču ekspresiju rekombinantnog proteina. Uvjeti s ograničenim kisikom aktiviraju promotor AOX1 putem nakupljanja metanola, povećavajući proizvodnju proteina uz smanjenje topline. Indukcija pri niskim temperaturama povećava prinos, aktivnost, stabilnost i održivost stanica, ali povećava troškove hlađenja. Ograničenje pH i dušika također pomaže ekspresiji, zahtijevajući oprez da se izbjegnu operativni problemi. Ograničenje dušika značajno povećava specifičnu produktivnost proteina.

Yaohai Bio-Pharma također aktivno traži institucionalne ili pojedinačne globalne partnere i nudi najkonkurentniju naknadu u industriji. Ukoliko imate pitanja, slobodno nas kontaktirajte: [email protected]