آماده‌سازی mRNA IVT

ترانسکریپشون در محیط بیرون از سلول (IVT) روش مورد علاقه برای آماده‌سازی mRNA است که قادر به تولید میکروگرم تا میلیگرم mRNA به صورت آزمایشگاهی است. برای اهداف تحقیقاتی، فراهم‌کنندگان عامل شیمیایی سیستم‌های واکنش IVT منعطفی طراحی کرده‌اند که مناسب برای mRNA با طول متوسط (1000-4000 نوکلئوتید) هستند.

در این مقاله، ما خلاصه‌ای از ترانسکریپشون در محیط بیرون از سلول (IVT) mRNA ارائه می‌دهیم، شامل سیستم واکنش IVT معمولی که در مقیاس آزمایشگاهی استفاده می‌شود و سیستم واکنش IVT مناسب برای mRNA فوق‌العاده طولانی (>9000 نوکلئوتید).

جعبه‌ابزارها اجازه داده می‌شود که حلقه‌بندی همزمان با CleanCap AG انجام شود و ایمنی‌زا بودن را با m1ψ کاهش دهد. DNase I DNA باقی‌مانده را حذف می‌کند. عملکرد پائین می‌تواند به علت مخلوط‌شدن نادرست، اکسیداسیون عوامل یا مشکلات مربوط به الیاف DNA باشد که می‌تواند با سنتrifوژ، استفاده از عوامل تازه، کنترل‌ها و تنظیم مقدار الیاف/زمان واکنش کاهش یابد.

یاوهای بیو-فارما مجموعه‌ای از محصولات پیش ساخته RNA IVT (مایع/پودر خشک شده) و محصولات نهایی LNP را ارائه می‌دهد که پروتئین‌هایی مانند پروتئین‌های فلوئورسنت (eGFP، mCHERRY)، لوسریفاز، رکامبن Cre و آنتی‌ژن OVA را کد می‌کنند تا به نیازهای مختلف آزمایشی یا پروژه‌ای پاسخ دهد.

سیستم IVT برای mRNA فوق‌العاده طولانی

IVT معمولی ممکن است برای mRNAهای بسیار طولانی (>9000 nt) کارآمد نباشد. نیاز به درک عمیق و تنظیم منطقی مولفه‌های IVT وجود دارد.

الگوی DNA: پلاسمیدهای خطی یا محصولات PCR با دنباله‌های پروموتر متناظر، محلول شده در H2O بدون RNase. توصیه می‌شود غلظت الگوی DNA بالاتر از 40 nM برای شرایط بهینه IVT باشد.

DTT: فعالیت انزیمی را طی ترانسکریپشن حفظ می‌کند. DTT تازه باید به بافر واکنش اضافه شود تا فعالیت انزیمی بهینه حفظ شود.

ممانعت‌کننده RNase: فعالیت RNase را مسدود می‌کند و پایداری mRNA را حفظ می‌کند.

پلیمراز RNA T7: کاتالیزور ترجمه DNA به RNA است، متناظر با دنباله پروموتر. فعالیت پلیمراز RNA نوع T7 تحت تأثیر pH و یون‌های آهنگین قرار می‌گیرد.

یون‌های آهنگین (Mg2+): هم‌عوامل پلیمراز RNA. غلظت‌های بسیار کم این یون‌ها کارایی ترجمه را کاهش می‌دهد، در حالی که غلظت‌های بیش از حد منجر به تجزیه RNA می‌شود. [Mg2+] آزاد باید بر اساس غلظت نوکلئوتید تنظیم شود. هر نوکلئوتید یک [Mg2+] را جذب می‌کند، بنابراین غلظت [Mg2+] باید بیشتر از مجموع غلظت نوکلئوتیدها باشد.

نوکلئوزید تریفسفات‌ها (NTP): به عنوان زیربنه‌ها، NTP‌ها واحد اصلی RNA هستند. غلظت‌های NTP بالاتر از 7 mM تأثیر مثبتی بر تولید mRNA دارد.

اسپرمیدین: پیوندهای DNA-انزیم را پایدار می‌کند و واکنش‌های ترجمه را تحریک می‌کند؛ اما غلظت‌های بیش از حد اثرات مهارکننده دارند. غلظت پیشنهادی اسپرمیدین بین 1 تا 3 mM است.

پیروفسفاتاز بدون آلی (PPase): افزوده شده به واکنش‌های IVT برای جلوگیری از تجمع یون‌های پیروفسفات نامعدنی (PPi)، جلوگیری از ترکیب آنها با Mg2+ و تضمین وجود مقدار کافی از Mg2+ آزاد.

با استفاده از فناوری نوین و تجربه در IVT mRNA، Yaohai Bio-Pharma خدمات کامل RNA IVT ارائه می‌دهد که شامل طراحی دنباله، آماده‌سازی RNA IVT (با ویرایشات m1ψ)، سیکل‌بندی RNA، تصفیه، خشک‌کردن، بسته‌بندی LNP و آزمایش کیفیت است.

ما همچنین به طور فعال در دنبال شرکای جهانی موسساتی یا افراد انفرادی هستیم. ما کمترین پاداش رقابتی را در صنعت ارائه می‌دهیم. اگر سوالی دارید، لطفاً حتماً با ما تماس بگیرید: [email protected]