آماده سازی mRNA IVT

رونویسی در شرایط آزمایشگاهی (IVT) روش ترجیحی برای تهیه mRNA است که قادر به تولید میکروگرم به میلی گرم mRNA در مقیاس آزمایشگاهی است. برای اهداف تحقیقاتی، تامین کنندگان معرف سیستم های واکنش IVT همه کاره را برای mRNA با طول متوسط ​​(1000-4000 نوکلئوتید) توسعه داده اند.

در این مقاله، رونویسی in vitro (IVT) mRNA را خلاصه می‌کنیم، از جمله سیستم واکنش متعارف IVT که در مقیاس آزمایشگاهی استفاده می‌شود و سیستم واکنش IVT مناسب برای mRNA بسیار طولانی (بیش از 9000 نوکلئوتید).

کیت ها پوشش رونویسی همزمان با CleanCap AG را فعال می کنند و ایمنی زایی را با m1ψ کاهش می دهند. DNase I DNA باقیمانده را حذف می کند. بازده کم می تواند به دلیل اختلاط ضعیف، اکسیداسیون معرف یا مشکلات الگوی DNA باشد که می تواند با سانتریفیوژ، معرف های تازه، کنترل ها و تنظیم مقدار/زمان واکنش الگو کاهش یابد.

Yaohai Bio-Pharma محصولات پیش ساخته IVT RNA (پودر مایع/خشک شده در انجماد) و محصولات نهایی LNP را ارائه می دهد که پروتئین هایی مانند پروتئین های فلورسنت (eGFP، mCHERRY)، لوسیفراز، recombinase Cre و آنتی ژن OVA را کدگذاری می کند تا با آزمایشات یا پروژه های مختلف روبرو شود. نیاز دارد.

سیستم IVT برای mRNA فوق طولانی

IVT معمولی ممکن است برای mRNA بسیار طولانی (بیش از 9000 nt) کار نکند. درک عمیق و تنظیم منطقی اجزای IVT مورد نیاز است.

الگوی DNA: پلاسمیدهای خطی یا محصولات PCR با توالی های پروموتر مربوطه، محلول در H2O بدون RNase. غلظت الگوی DNA بالاتر از 40 نانومولار برای شرایط بهینه IVT توصیه می شود.

DTT: فعالیت آنزیم را در طول رونویسی حفظ می کند. برای فعالیت بهینه آنزیم باید DTT تازه به بافر واکنش اضافه شود.

مهارکننده RNase: فعالیت RNase را مهار می کند و پایداری mRNA را حفظ می کند.

RNA پلیمراز T7: رونویسی DNA به RNA مربوط به توالی پروموتر را کاتالیز می کند. فعالیت RNA پلیمراز T7 تحت تأثیر pH و یون های منیزیم قرار می گیرد.

یون منیزیم (Mg2+): یک کوفاکتور برای RNA پلیمراز. غلظت های خیلی کم کارایی رونویسی را کاهش می دهد، در حالی که غلظت های خیلی زیاد منجر به تخریب RNA می شود. آزاد [Mg2+] باید بر اساس غلظت نوکلئوتید تنظیم شود. هر نوکلئوتید یک [Mg2+] را کلات می کند، بنابراین غلظت [Mg2+] باید از غلظت کل نوکلئوتید بیشتر شود.

نوکلئوزید تری فسفات ها (NTP): به عنوان سوبسترا، NTPها واحدهای اساسی RNA هستند. غلظت NTP بالای 7 میلی مولار تأثیر مثبتی بر تولید mRNA دارد.

اسپرمیدین: کمپلکس های آنزیم DNA را تثبیت می کند و واکنش های رونویسی را تحریک می کند. با این حال، غلظت بیش از حد دارای اثرات بازدارنده است. غلظت توصیه شده اسپرمیدین بین 1 تا 3 میلی مولار است.

پیروفسفاتاز معدنی (PPase): برای جلوگیری از تجمع یون‌های پیروفسفات معدنی (PPi)، جلوگیری از شل شدن آنها با Mg2+ و اطمینان از Mg2+ آزاد کافی، به واکنش‌های IVT اضافه شده است.

Yaohai Bio-Pharma با بهره گیری از فناوری پیشگام و تجربه mRNA IVT، یک سرویس IVT RNA یک مرحله ای را ارائه می دهد که شامل طراحی توالی، آماده سازی IVT RNA (با مدهای m1ψ)، چرخه سازی RNA، خالص سازی، خشک کردن انجمادی، محصورسازی LNP و آزمایش کیفیت است.

ما همچنین به طور فعال به دنبال شرکای جهانی نهادی یا فردی هستیم. ما رقابتی ترین پاداش را در صنعت ارائه می دهیم. اگر سوالی دارید، لطفا با ما تماس بگیرید: [email protected]