La protección del extremo 5' es una modificación esencial del ARNm. Los ARNm con estructuras cap, especialmente estructuras Cap1, facilitan que los ARNm evadan las respuestas inmunes innatas in vivo, lo que da como resultado una traducción eficiente de proteínas.
La protección enzimática (el método de dos pasos) es el método convencional de protección del ARNm, similar al proceso de protección en organismos eucariotas. Bajo la acción de una serie de enzimas, la 7-metilguanina (m7G) se une al extremo 5' del ARNm a través de un enlace trifosfato 5'-5' y sufre una modificación de metilación para formar la estructura de tapa Cap 1 (m7GpppN).
Diagrama de formación de la estructura de la capa natural.
El flujo de la reacción de protección enzimática es el siguiente:
El ADN plasmídico linealizado se utiliza como plantilla para la transcripción in vitro (IVT) en presencia de la polimerasa T7, y el ARNm con una estructura de extremo 5' se forma después de una purificación en un solo paso utilizando la enzima de protección de vaccinia y 2'-O. -metiltransferasa.
Detalles de servicios
Servicio opcional | Detalle de Servicios | Periodo de Entrega (Día) |
protección enzimática de ARNm | Reacción de protección enzimática | 1 |
Optimización de la reacción de limitación: opcional | Diseño y optimización de componentes de reacción. | 3 7 ~ |
Nuestras Características
- Diseño y optimización del componente de reacción de tapado.
El componente de la reacción de protección se optimiza y la producción de transcrito de ARNm aumenta considerablemente.
- Verificación de expresión in vitro.
El ARNm protegido se transfecta en células 293T y se puede detectar la expresión de la proteína diana.
- Control estricto de la RNasa
Mediante un control estricto del entorno experimental y los consumibles de RNaseson, se previene eficazmente la degradación del ARNm.
Estudio de caso
La plataforma de ARNm de Yaohai Bio-Pharma ha creado un proceso de reacción de protección perfecto.
Para el ARNm de eGFP, un preproducto de ARNm preparado mediante protección enzimática, se puede observar una señal de fluorescencia de eGFP (fluorescencia verde) a un alto nivel después de transfectar células 293T durante 24 horas, que se detecta mediante Western Blot (WB), lo que demuestra que el La proteína fluorescente verde mejorada con proteína diana (eGFP) se puede expresar eficientemente in vitro.
Expresión de ARNm de eGFP protegido enzimáticamente en células 293T
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