Con respecto a la preparación por lotes de precursores de ARN, un método comúnmente utilizado es la transcripción in vitro (IVT). La reacción IVT utiliza ADN plasmídico linealizado que contiene el promotor T7 como plantilla y sintetiza un precursor de ARN con trifosfatos de nucleósidos (NTP) como sustrato en presencia de la polimerasa de ARN T7.
Los métodos de ciclización in vitro incluyen la ligación química, la ligación enzimática y el método de intrón-exón permutado (PIE). La ligación química y la ligación enzimática son adecuadas para la ciclización de RNAs más cortos. Cuando el fragmento es mayor a 100 nt, la tasa de ciclización disminuirá considerablemente. En contraste, el método con base en el sistema PIE puede lograr la ciclización de secuencias de 8 kb.
Bajo la catalización del trifosfato de guanosina (GTP), la estructura PIE experimenta ciclización de secuencias extraintrónicas. Combinada con una estrategia razonable para aumentar la tasa de ciclización, Yaohai Bio-Pharma puede lograr ciclización de hasta 4 kb de secuencias, con una eficiencia de ciclización superior al 80%.
La reacción de ciclización in vitro del ARN fluye de la siguiente manera:
El precursor de ARN se sintetiza mediante transcripción in vitro, y el componente PIE completa su autosplicing bajo la catalización de GTP para formar circRNA.
Detalles de los Servicios
| Proceso |
Detalles del Servicio |
Período de Entrega (día laborable) |
| Transcripción in vitro y circulación |
Confirmación del sistema de reacción |
1-2 |
| Reacciones de Transcripción In Vitro y Ciclización |
| Digestión con RNasa R |
| Optimización de la reacción |
Composición de la Reacción, Optimización de Tiempo |
2-5 |
Nuestras características
- Diseño riguroso de pruebas y optimización
Se puede lograr la ciclización de hasta 4 kb de ARN.
- Alta eficiencia de ciclización
Se puede alcanzar una tasa de ciclización superior al 80% mediante una estrategia de optimización secuencial racional.
- Control Estricto de RNasa
Mediante un control estricto de las RNasas en el entorno experimental y los consumibles, se previene eficazmente la degradación del ARN.
Estudio de Caso
Ciclización y enriquecimiento in vitro de circRNA
Basado en el sistema PIE, Yaohai Bio-Pharma ha optimizado la secuencia de circRNA, con una tasa de ciclización superior al 80% por electroforesis en gel de agarosa (AGE). Usando RNasa R para enriquecer circRNA, los resultados de la electroforesis en E-gel muestran que el precursor de RNA lineal se digiere, y después de una purificación adicional, se puede eliminar la mayor parte del circRNA nicked. La solución de purificación ha sido desarrollada internamente por Yaohai Bio-Pharma.
Circulación y enriquecimiento in vitro de circRNA
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