En cuanto a la preparación por lotes de precursores de ARN, un método comúnmente utilizado es la transcripción in vitro (IVT). La reacción IVT utiliza ADN plasmídico linealizado que contiene el promotor T7 como plantilla y sintetiza un precursor de ARN con nucleósidos trifosfato (NTP) como sustrato en presencia de ARN polimerasa T7.
Los métodos de ciclación in vitro incluyen ligadura química, ligadura enzimática y método de intrón-exón permutado (PIE). La ligadura química y la ligadura enzimática son adecuadas para la ciclación de ARN más cortos. Cuando el fragmento tiene más de 100 nt, la tasa de ciclación disminuirá considerablemente. Por el contrario, el método de la nucleasa basado en el sistema PIE puede lograr la ciclación de secuencias de 8 kb.
Bajo la catálisis del trifosfato de guanosina (GTP), la estructura PIE sufre ciclación de secuencias extraintrón. Combinado con una estrategia razonable para aumentar la tasa de ciclación, Yaohai Bio-Pharma puede lograr la ciclación de secuencias de hasta 4 kb, con una eficiencia de ciclación de más del 80%.
La reacción de ciclación in vitro del ARN fluye de la siguiente manera:
El precursor de ARN se sintetiza mediante transcripción in vitro y el componente PIE completa su autoempalme bajo la catálisis de GTP para formar ARNcirc.
Detalles de servicios
| Proceso | Detalle de Servicios | Plazo de entrega (día laborable) |
| Transcripción y circulación in vitro. | Confirmación del sistema de reacción. | 1 - 2 |
| Reacciones de transcripción y ciclación in vitro. |
| Digestión de RNasa R |
| Optimización de la reacción | Composición de la reacción, optimización del tiempo. | 2 - 5 |
Nuestras Características
- Diseño y optimización de pruebas rigurosas
Se pueden lograr hasta 4 kb de ciclación de ARN.
- Alta eficiencia de ciclación
Se puede lograr una tasa de ciclación de más del 80% mediante una estrategia de optimización de secuencia racional.
- Control estricto de la RNasa
Mediante un control estricto de las RNasas en el entorno experimental y los consumibles, se previene eficazmente la degradación del ARN.
Estudio de caso
Ciclización in vitro y enriquecimiento de circRNA.
Basándose en el sistema PIE, Yaohai Bio-Pharma ha optimizado la secuencia de circRNA, con una tasa de ciclación superior al 80% mediante electroforesis en gel de agarosa (AGE). Usando RNase R para enriquecer el circRNA, los resultados de la electroforesis en gel E muestran que el precursor de RNA lineal se digiere y, después de una purificación adicional, la mayor parte del circRNA mellado se puede eliminar. La solución de purificación es de desarrollo propio de Yaohai Bio-Pharma.
Circulación in vitro y enriquecimiento de circRNA.
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