mRNA 3' poly(A) charakterizace
mRNA 3' poly(A) charakterizace
3' poly(A) konec (polyadenosiny) mRNA je integrální součástí post-transkripční regulace, ovlivňuje export, stabilitu a translaci mRNA. V případě in vitro transkribovaných (IVT) mRNA je poly(A) konec zaváděn buď během společné transkripce templátovaným způsobem nebo prostřednictvím enzymatického tailingu netemplátovým způsobem. Tento 3′ poly(A) slouží jako kritický atribut kvality (CQA) pro IVT RNA, což vyžaduje důkladnou charakterizaci během vývoje procesu i uvolňování šarží.
Yaohai Bio-Pharma poskytuje specializované 3' poly(A) charakterizační služby využívající techniky, jako je štěpení ribonukleázou T1 (RNáza T1), vysokoúčinná kapalinová chromatografie na iontovém páru s reverzní fází (IP-RP-HPLC)/kapalinová chromatografie-hmotnostní spektrometrie (LC-MS) a komplexní analýzu dat.
Regulační požadavky na charakterizaci mRNA 3' poly(A).
Podle regulačních úvah WHO je „integrita struktury mRNA považována za kritický atribut kvality pro uvolňování mRNA. Je tedy potřeba kontrola integrity mRNA, účinnosti 5' capping, 3' přítomnosti nebo délky poly(A) ocasu a tak dále.
Analytická metoda
Analýza |
Metody |
mRNA 3' poly(A) charakterizace |
LC-MS po štěpení |
Postup
Krok 1. Štěpení RNázy T1
Přímá analýza intaktní mRNA plné délky pomocí LC-MS je nepraktická kvůli její velikosti a heterogenitě. Aby bylo možné prozkoumat poly(A) ocas, musí být odštěpen z mRNA plné délky. Převládající metoda zahrnuje enzymatické štěpení RNázou T1, selektivní štěpení 3' konce rG při zachování poly(A) sekvence. Vzorek mRNA se štěpí RNázou T1 a štěpící fragmenty obsahující poly(A) úseky se izolují pomocí magnetických kuliček potažených oligo dT.
Krok 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
Extrahované ocasy prošly analýzou pomocí LC-MS, která nabízí přesné informace o délce ocasu při rozlišení jednoho nukleotidu. V oligonukleotidové LC-MS analýze jsou separace s reverzní fází s iontovým párem (IP-RP) s aminovými aditivy mobilní fáze preferovaným chromatografickým způsobem díky jejich robustní rozlišovací schopnosti a kompatibilitě s hmotnostní spektrometrií (MS).
Krok 3. Analýza dat
Délka ocasu poly(A) a jeho relativní četnost závisí na počtu a intenzitě píku dělené hmotností adenosinu. Po zpracování nebo dekonvoluci hmotnostního spektra se rozezná očekávaná hmotnost 100-merního poly(A) ocasu (33,163 329 Da v rámečku), doprovázená sérií hmotností s odstupem XNUMX amu, což je ekvivalentní hmotnosti adenosinu (A) .
Případ 3' poly(A) charakterizace pomocí LC–MS
Yaohai-BioPharma vyvinula robustní metodu pro charakterizaci mRNA 3' poly(A), včetně štěpení RNázou T1 a IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma vyvinula robustní metodu pro charakterizaci mRNA 3' poly(A), včetně štěpení RNázou T1 a IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
