Účinnost zakončení mRNA 5'
Význam analýzy účinnosti mRNA 5'capping
Struktura čepičky umístěná na 5' konci mRNA hraje klíčovou roli v účinné translaci, stabilizaci a transportu mRNA v eukaryotech. V kontextu in vitro transkribované (IVT) mRNA je 5' čepička zavedena buď ko-transkripčním čepičkou nebo enzymatickou čepičkou. Jako nepostradatelná složka IVT RNA je 5′ uzávěr kritickým atributem kvality (CQA), který vyžaduje komplexní charakterizaci během vývoje procesu a uvolňování šarží.
Yaohai-Bio Pharma poskytuje komplexní řešení pro analýzu účinnosti 5' capping, zahrnující design oligonukleotidových dlah (sondy), štěpení RNázou H, IP-RP-iontový pár s reverzní fází vysokoúčinné kapalinové chromatografie (IP-RP-HPLC)/kapalinové chromatografie -hmotnostní spektrometrie (LC-MS), analýza dat.
Regulační požadavky na integritu mRNA
Podle regulačních úvah WHO je „integrita struktury mRNA považována za kritický atribut kvality pro uvolňování mRNA. Je tedy potřeba kontrola integrity mRNA, účinnosti 5' capping, 3' přítomnosti nebo délky poly(A) ocasu a tak dále.
Analytická metoda
Analýza |
Metody |
Účinnost zakončení mRNA 5' |
LC-MS po štěpení |
Postup
Krok 1. Návrh oligonukleotidové dlahy (sondy).
Štěpící sonda, zahrnující 2'-O-methylnukleotidy a tetradeoxyribonukleotidy, slouží ke štěpení komplementárního řetězce RNA ve specifických polohách, když je přítomna RNáza H. Tato metoda se ukazuje jako vysoce hodnotná pro cílené vytváření větších fragmentů RNA.
Krok 2. Štěpení RNázy H
Biotinylovaná sonda, strategicky navržená tak, aby byla komplementární k 5' konci mRNA, se aplikuje ve spojení s RNázou H, aby katalyzovala cílené štěpení oligonukleotidu na 5' konci, který má strukturu čepičky.
Krok 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
V oligonukleotidové LC-MS analýze je výhodným chromatografickým způsobem separace na reverzní fázi s iontovým párováním (IP-RP) využívající aminové mobilní fáze aditiv. To je přičítáno jejich vynikající rozlišovací schopnosti a kompatibilitě s hmotnostní spektrometrií (MS).
Krok 4. Analýza dat
Odlišné hmotnosti pozorované ve fragmentech štěpení s čepičkou m7GpppG, na rozdíl od těch s difosfátovou, trifosfátovou nebo nemethylovanou čepičkou G (GpppG), usnadňují jejich identifikaci a umožňují odhad účinnosti čepičky.
Případ analýzy účinnosti uzávěru pomocí LC–MS
Yaohai-Bio Pharma vyvinula robustní metody pro analýzu účinnosti zakrytí mRNA, od návrhu oligonukleotidových dlah (sondy), štěpení RNázou H, IP-RP-HPLC/LC-MS až po analýzu dat.
Celkové iontové chromatogramy (vlevo) a elektrosprejová hmotnostní spektra (vpravo) 5'koncových štěpných fragmentů
EN
