Pokud jde o hromadnou výrobu mRNA, transkripce in vitro (IVT) je efektivnější a dospělejší metoda. Reakce IVT používá linearizovanou plazmidovou DNA obsahující T7 promotor jako šablonu a mRNA je syntetizována s nukleotidtrifosfáty (NTPs) jako substráty v přítomnosti polymerázy T7 RNA.
Modifikace nukleotidů je průlomem v průzkumu mRNA, kde nezamodifikované mRNA molekuly jsou rozpoznány intracelulárními senzory RNA, které aktivují vrozenou imunitu. Z důvodu imunogenity mRNA in vivo a účinnosti překladu se v procesu IVT obvykle používají určité druhy modifikovaných NTPs a běžné modifikované nukleotidy jsou pseudouridine (Ψ), N1-methyl-pseudouridine (N1Ψ) a 5-methylcytosine (5mC).
Proces transkripce in vitro mRNA
Schéma reakce transkripce in vitro (IVT)
Detaily služeb
Volitelná služba |
Detaily služby |
Doba dodání (pracovní den) |
Transkripcese v vitro (IVT) |
IVT, In vitro transkripcí |
1 |
| Modifikace nukleotidů (Ψ/N1Ψ/5mC atd.) |
| Odstranění DNA šablony (DNase I) |
Optimalizace podmínek IVT - volitelné |
Návrh a optimalizace složek reakce IVT |
2-5 |
Naše funkce
- Rozmanité strategie úpravy nukleotidů
Zlepšení stability mRNA a expresivity bílkovin in vivo.
- Přísné navrhování a optimalizace testů
příprava fragmentů mRNA až 10kb je možná.
Díky optimalizaci podmínek reakce IVT je rychlost transkripcí až 1:200.
Přísná kontrola RNase prostřednictvím experimentálního prostředí a spotřebičů může účinně zabránit degradaci mRNA.
Případová studie
Současný systém reakce IVT je přibližně optimalizován pro syntetické systémy s délkou asi 100 nt, nikoli pro mRNA libovolné délky. Čím delší je sekvence mRNA, tím obtížnější je její transkripce a tím více je náchylná k degradaci.
Aby bylo možné připravit přizpůsobené mRNA sekvence s délkou asi 10 kb, společnost Yaohai Bio-Pharma úspěšně připravila vysokokvalitní vzorky s vysokým poměrem transkripce 1:135 a získala 135 μg počátečně očištěných mRNA produktů po in vitro transkripci 1 μg linearizovaného plasmidu díky pečlivému experimentálnímu návrhu, nepřetržité optimalizaci podmínek reakce a přísné kontrole RNase.
identifikace mRNA (elektroforeze na agaróse)
EN
AR
HR
CS
DA
NL
FI
FR
DE
EL
IT
JA
KO
NO
PL
PT
RO
RU
ES
SV
IW
ID
LV
LT
SR
SK
SL
UK
VI
ET
HU
TH
TR
FA
AF
MS
BE
MK
UR
BN
