Pokud jde o dávkovou přípravu prekurzorů RNA, běžně používanou metodou je in vitro transkripce (IVT). Reakce IVT používá linearizovanou plazmidovou DNA obsahující T7 promotor jako šablonu a syntetizuje prekurzor RNA s nukleosid-trifosfáty (NTP) jako substrát v přítomnosti T7 RNA polymerázy.
Metody cyklikace in vitro zahrnují chemickou ligaci, enzymatickou ligaci a metodu permutovaného intron-exon (PIE). Chemická ligace a enzymatická ligace jsou vhodné pro cyklikaci kratších RNA. Pokud je fragment delší než 100 nt, rychlost cyklikace se výrazně sníží. Naopak metoda nukleáz založená na systému PIE může dosáhnout cyklikace sekvencí délky 8 kb.
Pod katalýzou guanosin-trifosfátu (GTP) dochází u struktury PIE ke cyklikaci extra-intronových sekvencí. Spojením s rozumnou strategií zvyšující rychlost cyklikace může Yaohai Bio-Pharma dosáhnout cyklikace sekvencí délkou až 4 kb s efektivitou více než 80 %.
Reakce cyklikace RNA in vitro probíhá následovně:
Předchůdce RNA je syntetizován in vitro transkripcí a komponenta PIE dokončí samo-splicing pod katalýzou GTP, aby vytvořila circRNA.
Proces | Detaily služby | Doba dodání (pracovní den) |
Transkripcese in vitro a cirkulace | Potvrzení reakčního systému | 1-2 |
Reakce transkripcese in vitro a cyklizace | ||
Destruckce RNase R | ||
Optimalizace reakce | Skladba reakce, optimalizace času | 2-5 |
Lze dosáhnout cyklikace RNA až do délky 4 kb.
Dosažitelnost míry cyklikace přes 80 % pomocí racionální strategie optimalizace sekvence.
Přes prostřednictví přísné kontroly RNasů v experimentálním prostředí a spotřebičích je účinně zabráněno degradaci RNA.
In vitro cyklikace a obohacování circRNA
Na základě systému PIE firma Yaohai Bio-Pharma optimalizovala sekvenci circRNA, s mírou cyklikace více než 80% podle elektroforeze v agárovém gelem (AGE). Pomocí RNase R se obohacuje circRNA, výsledky elektroforeze E-gel ukazují, že lineární RNA předchůdce je vyžehlen, a po dalším čištění lze odebrat většinu poškozené circRNA. Čištěcí roztok byl vyvinut vlastními silami Yaohai Bio-Pharma.
In vitro cyklikace a obohacování circRNA