Eficiência de cobertura de mRNA 5'
O significado da análise de eficiência do mRNA 5'capping
A estrutura cap localizada na extremidade 5 'do mRNA desempenha um papel fundamental na tradução, estabilização e transporte eficientes de mRNAs dentro de eucariotos. No contexto do mRNA transcrito in vitro (IVT), o cap 5' é introduzido através de processos de capeamento co-transcricional ou de capeamento enzimático. Como um componente indispensável dos RNAs IVT, o limite 5 'se destaca como um atributo crítico de qualidade (CQA), necessitando de caracterização abrangente durante todo o desenvolvimento do processo e liberação do lote.
A Yaohai-Bio Pharma fornece soluções abrangentes de análise de eficiência de capeamento de 5', abrangendo design de talas de oligonucleotídeos (sonda), clivagem de RNase H, cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa de par de íons IP-RP (IP-RP-HPLC)/cromatografia líquida -espectrometria de massa (LC-MS), análise de dados.
Requisitos regulamentares para integridade do mRNA
De acordo com as considerações regulamentares da OMS, “a integridade da estrutura do mRNA é considerada um atributo de qualidade crítico para a libertação do mRNA. Assim, o controle é necessário para a integridade do mRNA, eficiência de capeamento 5′, presença ou comprimento da cauda 3′ poli(A) e assim por diante.”
Método Analítico
Análise | De Depósito |
Eficiência de cobertura de mRNA 5' | LC-MS após digestão |
Procedimento
Etapa 1. Projeto de talas oligonucleotídicas (sonda)
A sonda de clivagem, incorporando 2'-O-metilnucleótidos e tetradesoxirribonucleótidos, serve para clivar uma cadeia de ARN complementar em posições específicas quando a RNase H está presente. Este método revela-se altamente valioso para a geração direcionada de fragmentos maiores de RNA.
Passo 2. Clivagem de RNase H
Uma sonda biotinilada, estrategicamente concebida para ser complementar à extremidade 5' do ARNm, é aplicada em conjunto com a RNase H para catalisar a clivagem direccionada do oligonucleótido da extremidade 5' que possui uma estrutura cap.
Etapa 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
Na análise de oligonucleotídeos LC-MS, o modo cromatográfico preferido são separações de fase reversa de pareamento iônico (IP-RP) utilizando aditivos de fase móvel de amina. Isto é atribuído ao seu poder de resolução superior e compatibilidade com espectrometria de massa (MS).
Passo 4. Análise de dados
Massas distintas observadas em fragmentos de clivagem apresentando um cap m7GpppG, em contraste com aqueles com difosfato, trifosfato ou cap G não metilado (GpppG), facilitam sua identificação e permitem a estimativa da eficiência do capeamento.
Caso de análise de eficiência de nivelamento com LC-MS
A Yaohai-Bio Pharma desenvolveu métodos robustos para análise de eficiência de capeamento de mRNA, desde design de talas de oligonucleotídeos (sonda), clivagem de RNase H, IP-RP-HPLC/LC-MS até análise de dados.
Os cromatogramas de íons totais (esquerda) e espectros de massa de eletrospray (direita) dos fragmentos de clivagem da extremidade 5'
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