Em relação à preparação em lote de precursores de RNA, um método comumente utilizado é a transcrição in vitro (IVT). A reação IVT usa DNA plasmídico linearizado contendo o promotor T7 como modelo e sintetiza um precursor de RNA com nucleosídeo trifosfato (NTPs) como substrato na presença de RNA polimerase de T7.
Os métodos de ciclização in vitro incluem ligação química, ligação enzimática e método íntron-éxon permutado (PIE). A ligação química e a ligação enzimática são adequadas para a ciclização de RNAs mais curtos. Quando o fragmento for maior que 100 nt, a taxa de ciclização diminuirá bastante. Em contraste, o método de nuclease baseado no sistema PIE pode conseguir a ciclização de sequências de 8 kb.
Sob a catálise do trifosfato de guanosina (GTP), a estrutura PIE sofre ciclização de sequências extra-íntrons. Combinada com uma estratégia razoável para aumentar a taxa de ciclização, a Yaohai Bio-Pharma pode alcançar a ciclização de sequências de até 4 kb, com uma eficiência de ciclização de mais de 80%.
A reação de ciclização in vitro do RNA ocorre da seguinte forma:
O precursor do RNA é sintetizado por transcrição in vitro, e o componente PIE completa o auto-splicing sob a catálise do GTP para formar o circRNA.
Detalhes dos serviços
| Extração | Detalhes de serviços | Período de entrega (dia útil) |
| Transcrição e circulação in vitro | Confirmação do sistema de reação | 1-2 |
| Reações de transcrição e ciclização in vitro |
| Digestão RNase R |
| Otimização de reação | Composição da reação, otimização do tempo | 2-5 |
Nossos recursos
- Design e otimização de testes rigorosos
Podem ser alcançados até 4 kb de ciclização de RNA.
- Alta eficiência de ciclização
Uma taxa de ciclização de mais de 80% pode ser alcançada através de uma estratégia racional de otimização de sequência.
- Controle rigoroso de RNase
Através do controle rigoroso das RNases no ambiente experimental e nos consumíveis, a degradação do RNA é efetivamente evitada.
Estudo de caso
Ciclização in vitro e enriquecimento de circRNA
Com base no sistema PIE, a Yaohai Bio-Pharma otimizou a sequência do circRNA, com uma taxa de ciclização superior a 80% por eletroforese em gel de agarose (AGE). Usando RNase R para enriquecer o circRNA, os resultados da eletroforese em gel E mostram que o precursor linear do RNA é digerido e, após purificação adicional, a maior parte do circRNA cortado pode ser removida. A solução de purificação foi desenvolvida pela própria Yaohai Bio-Pharma.
Circulação in vitro e enriquecimento de circRNA
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