Charakterystyka mRNA 3' poli(A).
Charakterystyka mRNA 3' poli(A).
Ogon 3' poli(A) (poliadenozyny) mRNA jest integralną częścią regulacji potranskrypcyjnej, wpływając na eksport, stabilność i translację mRNA. W przypadku mRNA transkrybowanych in vitro (IVT), ogon poli(A) wprowadza się albo podczas kotranskrypcji w sposób oparty na matrycy, albo w procesie enzymatycznego ogonowania w sposób bez szablonu. Ten 3' poli(A) służy jako krytyczny atrybut jakości (CQA) dla RNA IVT, wymagający dokładnej charakteryzacji zarówno podczas opracowywania procesu, jak i zwalniania partii.
Yaohai Bio-Pharma świadczy specjalistyczne usługi charakteryzacji 3' poli(A), wykorzystując techniki takie jak rozszczepianie rybonukleazy T1 (RNaza T1), wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami na parach jonowych (IP-RP-HPLC)/chromatografia cieczowa-spektrometria mas (LC-MS) i kompleksową analizę danych.
Wymagania prawne dotyczące charakterystyki mRNA 3' poli(A).
Według ustaleń regulacyjnych WHO „integralność struktury mRNA uważa się za kluczową cechę jakości uwalniania mRNA. Zatem konieczna jest kontrola integralności mRNA, wydajności zamykania 5′, obecności lub długości ogona 3′ poli(A) i tak dalej.”
Metoda analityczna
Analiza | Metody |
Charakterystyka mRNA 3' poli(A). | LC-MS po trawieniu |
Procedura
Krok 1. Cięcie RNazą T1
Bezpośrednia analiza nienaruszonego mRNA pełnej długości za pomocą LC-MS jest niepraktyczna ze względu na jego rozmiar i niejednorodność. Aby zbadać ogon poli(A), należy go odciąć od mRNA pełnej długości. Przeważająca metoda polega na trawieniu enzymatycznym RNazą T1, selektywnie odcinając koniec 3' rG, zachowując sekwencję poli(A). Próbkę mRNA poddaje się trawieniu RNazą T1, a rozszczepione fragmenty zawierające odcinki poli(A) izoluje się przy użyciu kulek magnetycznych pokrytych oligo dT.
Krok 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
Wyekstrahowane ogony poddano analizie za pomocą LC-MS, która dostarczyła dokładnych informacji o długości ogona przy rozdzielczości pojedynczego nukleotydu. W analizie oligonukleotydów LC-MS, preferowanym trybem chromatograficznym jest rozdzielanie par jonowych w fazie odwróconej (IP-RP) z aminowymi dodatkami fazy ruchomej ze względu na ich dużą zdolność rozdzielczą i zgodność ze spektrometrią mas (MS).
Krok 3. Analiza danych
Długość ogona poli(A) i jego względna liczebność zależą od liczby i intensywności pików podzielonej przez masę adenozyny. Po przetworzeniu lub rozłożeniu widma masowego określa się przewidywaną masę 100-merowego ogona poli(A) (33,163 329 Da w pudełku), której towarzyszy szereg mas oddalonych o XNUMX amu, co odpowiada masie adenozyny (A) .
Przypadek 3' poli(A) Charakterystyka za pomocą LC-MS
Yaohai-BioPharma opracowała solidną metodę charakteryzowania 3' poli(A) mRNA, w tym rozszczepianie RNazą T1 i IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma opracowała solidną metodę charakteryzowania 3' poli(A) mRNA, w tym rozszczepianie RNazą T1 i IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
