Skuteczność zamykania 5' mRNA
Znaczenie analizy wydajności 5'cappingu mRNA
Struktura czapeczki zlokalizowana na końcu 5' mRNA odgrywa kluczową rolę w skutecznej translacji, stabilizacji i transporcie mRNA w eukariontach. W kontekście mRNA transkrybowanego in vitro (IVT), czapeczka 5' jest wprowadzana albo w procesie kotranskrypcji czapeczki, albo enzymatycznej. Jako niezbędny składnik RNA IVT, czapeczka 5′ jest krytycznym atrybutem jakości (CQA), wymagającym kompleksowej charakterystyki na każdym etapie rozwoju procesu i zwalniania serii.
Yaohai-Bio Pharma zapewnia kompleksowe rozwiązania do analizy wydajności 5' cappingu, obejmujące projektowanie szyn oligonukleotydowych (sondy), rozszczepianie RNazy H, IP-RP-wysokosprawną chromatografię cieczową z parami jonowymi w odwróconych fazach (IP-RP-HPLC)/chromatografię cieczową -spektrometria mas (LC-MS), analiza danych.
Wymagania regulacyjne dotyczące integralności mRNA
Według ustaleń regulacyjnych WHO „integralność struktury mRNA uważa się za kluczową cechę jakości uwalniania mRNA. Zatem konieczna jest kontrola integralności mRNA, wydajności zamykania 5′, obecności lub długości ogona 3′ poli(A) i tak dalej.”
Metoda analityczna
Analiza |
Metody |
Skuteczność zamykania 5' mRNA |
LC-MS po trawieniu |
Procedura
Krok 1. Projektowanie szyn (sond) oligonukleotydowych
Sonda rozszczepiająca, zawierająca 2'-O-metylonukleotydy i tetradeoksyrybonukleotydy, służy do rozcięcia komplementarnej nici RNA w określonych pozycjach, gdy obecna jest RNaza H. Metoda ta okazuje się bardzo cenna w przypadku ukierunkowanego wytwarzania większych fragmentów RNA.
Krok 2. Rozszczepienie RNazą H
Biotynylowaną sondę, strategicznie zaprojektowaną tak, aby była komplementarna do końca 5' mRNA, stosuje się w połączeniu z RNazą H w celu katalizowania docelowego rozszczepienia oligonukleotydu na końcu 5' posiadającego strukturę czapeczki.
Krok 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
W analizie oligonukleotydów LC-MS preferowanym trybem chromatograficznym jest rozdzielanie par jonowych w fazie odwróconej (IP-RP) z wykorzystaniem aminowych dodatków do fazy ruchomej. Przypisuje się to ich doskonałej zdolności rozdzielczej i zgodności ze spektrometrią mas (MS).
Krok 4. Analiza danych
Wyraźne masy obserwowane we fragmentach rozszczepionych z czapeczką m7GpppG, w przeciwieństwie do fragmentów z czapeczką difosforanową, trifosforanową lub niemetylowaną G (GpppG), ułatwiają ich identyfikację i umożliwiają ocenę efektywności czapeczki.
Przypadek analizy efektywności ograniczania za pomocą LC–MS
Firma Yaohai-Bio Pharma opracowała niezawodne metody analizy wydajności czapeczkowania mRNA, począwszy od projektowania szyn oligonukleotydowych (sondy), rozszczepiania RNazą H, IP-RP-HPLC/LC-MS po analizę danych.
Chromatogramy jonów całkowitych (po lewej) i widma masowe przez elektrorozpylanie (po prawej) fragmentów rozszczepionych na końcu 5'
EN
