mRNA 3' poly(A) karakterisering
mRNA 3' poly(A) karakterisering
3' poly(A) halen (polyadenosiner) av mRNA er integrert i post-transkripsjonell regulering, og påvirker mRNA eksport, stabilitet og translasjon. Når det gjelder in vitro-transkriberte (IVT) mRNA-er, introduseres poly(A)-halen enten under co-transkripsjon på en malt måte eller gjennom en enzymatisk haleprosess på en ikke-templert måte. Denne 3′ poly(A) fungerer som et kritisk kvalitetsattributt (CQA) for IVT RNA, noe som krever grundig karakterisering under både prosessutvikling og batchfrigivelse.
Yaohai Bio-Pharma tilbyr spesialiserte 3' poly(A) karakteriseringstjenester, ved bruk av teknikker som ribonuklease T1 (RNase T1) spaltning, ion-par reversert fase høyytelses væskekromatografi (IP-RP-HPLC)/væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS), og omfattende dataanalyse.
Regulatoriske krav for mRNA 3' poly(A) karakterisering
I følge WHOs regulatoriske betraktninger, "anses integriteten til strukturen til mRNA å være en kritisk kvalitetsegenskap for frigjøring av mRNA. Derfor er det nødvendig med kontroll for mRNA-integritet, 5′-kappingseffektivitet, 3′ poly(A)-haletilstedeværelse eller lengde og så videre.»
Analytisk metode
Analyse | Metoder |
mRNA 3' poly(A) karakterisering | LC-MS etter fordøyelsen |
Prosedyre
Trinn 1. RNase T1-spaltning
Direkte analyse av intakt mRNA i full lengde med LC-MS er upraktisk på grunn av størrelsen og heterogeniteten. For å undersøke poly(A) halen, må den spaltes fra mRNA i full lengde. Den utbredte metoden involverer enzymatisk fordøyelse med RNase T1, selektiv spaltning av 3'-enden av rG mens poly(A)-sekvensen bevares. mRNA-prøven gjennomgår fordøyelse med RNase T1, og spaltningsfragmenter som inneholder poly(A)-strekninger isoleres ved bruk av oligo dT-belagte magnetiske kuler.
Trinn 2. IP-RP-HPLC/LC-MS
De ekstraherte halene gjennomgikk analyse ved bruk av LC-MS, og tilbyr presis halelengdeinformasjon ved enkeltnukleotidoppløsning. I oligonukleotid LC-MS-analyse står ioneparende omvendt fase (IP-RP) separasjoner med aminmobilfase-additiver som den foretrukne kromatografiske modusen, på grunn av deres robuste oppløsningsevne og kompatibilitet med massespektrometri (MS).
Trinn 3. Dataanalyse
Poly(A)-halelengden og dens relative overflod avhenger av antall og intensitet av topper delt på en masse adenosin. Ved prosessering eller dekonvoluering av massespekteret, oppdages den forventede massen til en 100-mer poly(A) hale (33,163 329 Da i boks), ledsaget av en serie masser adskilt med XNUMX amu, tilsvarende massen av adenosin (A) .
Tilfelle av 3' poly(A) Karakterisering med LC–MS
Yaohai-BioPharma har utviklet en robust metode for mRNA 3' poly(A) karakterisering, inkludert RNase T1 spaltning og IP-RP-HPLC/LC-MS.
Yaohai-BioPharma har utviklet en robust metode for mRNA 3' poly(A) karakterisering, inkludert RNase T1 spaltning og IP-RP-HPLC/LC-MS.
EN
