mRNA 5'capping effektivitet
Betydningen av mRNA 5'capping effektivitetsanalyse
Cap-strukturen plassert ved 5'-enden av mRNA spiller en sentral rolle i effektiv translasjon, stabilisering og transport av mRNA i eukaryoter. I sammenheng med in vitro-transkribert (IVT) mRNA, introduseres 5'-hetten gjennom enten co-transkripsjonell kapping eller enzymatiske kappingsprosesser. Som en uunnværlig komponent i IVT RNA, står 5′-hetten som en kritisk kvalitetsattributt (CQA) som krever omfattende karakterisering gjennom prosessutvikling og batchfrigivelse.
Yaohai-Bio Pharma tilbyr omfattende 5'-dekkeeffektivitetsanalyseløsninger, som omfatter oligonukleotidskinnedesign (probe), RNase H-spalting, IP-RP-ion-par reversert fase høyytelses væskekromatografi (IP-RP-HPLC)/væskekromatografi -massespektrometri (LC-MS), dataanalyse.
Regulatoriske krav for mRNA-integritet
I følge WHOs regulatoriske betraktninger, "anses integriteten til strukturen til mRNA å være en kritisk kvalitetsegenskap for frigjøring av mRNA. Derfor er det nødvendig med kontroll for mRNA-integritet, 5′-kappingseffektivitet, 3′ poly(A)-haletilstedeværelse eller lengde og så videre.»
Analytisk metode
Analyse |
Metoder |
mRNA 5'capping effektivitet |
LC-MS etter fordøyelsen |
Prosedyre
Trinn 1. Design av oligonukleotidskinner (probe).
Spaltningsproben, som inkorporerer 2'-O-metylnukleotider og tetradeoksyribonukleotider, tjener til å spalte en komplementær RNA-streng i spesifikke posisjoner når RNase H er tilstede. Denne metoden viser seg å være svært verdifull for målrettet generering av større RNA-fragmenter.
Trinn 2. RNase H-spaltning
En biotinylert probe, strategisk utformet for å være komplementær til 5'-enden av mRNA, påføres i forbindelse med RNase H for å katalysere den målrettede spaltningen av 5'-endeoligonukleotidet som har en cap-struktur.
Trinn 3. IP-RP-HPLC/LC-MS
I oligonukleotid LC-MS-analyse er den foretrukne kromatografiske modusen ioneparende reversfase-separasjoner (IP-RP) ved bruk av amin-mobilfase-additiver. Dette tilskrives deres overlegne oppløsningsevne og kompatibilitet med massespektrometri (MS).
Trinn 4. Dataanalyse
Distinkte masser observert i spaltningsfragmenter med en m7GpppG-hette, i motsetning til de med en difosfat-, trifosfat- eller umetylert G-kappe (GpppG), letter identifiseringen av dem og muliggjør estimering av avdekningseffektivitet.
Tilfelle av analyse av avgrensningseffektivitet med LC–MS
Yaohai-Bio Pharma har utviklet robuste metoder for mRNA-begrensningseffektivitetsanalyse, fra design av oligonukleotidskinne (probe), RNase H-spalting, IP-RP-HPLC/LC-MS til dataanalyse.
De totale ionekromatogrammene (venstre) og elektrospraymassespektra (høyre) av 5'-endes spaltningsfragmenter
EN
