הarnessing הכוח של אסטרטגיית פרמנטציה Fed-batch

Pichia pastoris נמצאת בשימוש רחבה בייצור חלבונים הטרולוגיים שונים. טכנולוגיית התסיסה בדENSITY גבוהה (HCDF), המופעלת באמצעות תזון Fed-Batch, הצליחה להשיג ייצור מסיבי של ביופרמצבים ואנזימים תעשייתיים. בתנאים מדויקים של אמצעי גידול, שימוש בטכנולוגיה HCDF יכול להפיק חלבונים רקורסנטיים בעלי תוצר גבוה, פעילות גבוהה ויעולים כלכליים.

מחקרים אחרונים מצביעים על כך שאסטרטגיות HCDF מנסות להגדיל את הייצור והפעילות של חלבונים הטרולוגיים ב-Pichia pastoris. טכנולוגיית HCDF מאפשרת להשיג בקלות קבוצות תאיות ברמה גבוהה באמצעי גידול מוגדרים, מה שמאפשר להשיג כמויות גדולות של חלבונים רקורסנטיים בעלי פעילות משופרת ועומס כלכלי מופחת באמצעות HCDF. עם זאת, בחירת האסטרטגיה המתאימה של HCDF כדי ליטול את הביטוי ברמה גבוהה של חלבונים ספציפיים ב-Pichia pastoris עדיין מהווה אתגר.

התסיסה בדENSITY גבוהה (HCDF)

Pichia pastoris מבריקה בייצור חלבונים הטרולוגיים, ומפוקחת במיוחד עבור HCDF בביו-ריאקטורים אוטומטיים. HCDF כולל שלושה שלבים: גליקול בצורת חטיף, תזונה ותסיסה של מתנול. Yaohai Bio-Pharma מציגה יותר מעשור נסיון בתחום התסיסה המיקרובית ושימשה במעל 400 פרויקטים. החברה מחזיקה בידע רחבה ובטכנולוגיה מפותחת היטב, מה שמאפשר לה להשתמש בשיטות HCDF שונות כדי לשפר את יעילות ייצור החלבונים.

מתנול משמש הן כמגביר של AOX1 והן כמקור פחמן, אך יש לשלוט בריכוזו כדי למנוע רעלנות. הערכת שיטות תזונה שונות של מתנול היא קריטית לשיפור צמיחת Pichia pastoris והבעת חלבונים.

שיטה לתסיסה של מתנול

באסטרטגיה של HCDF עם תוספת מתנול בהפעלה מופעלת, אסטרטגיות הפעלה מבוססות מצב כוללות קבוצה של שיטות בקרת שמנצחות את התוספת המשנית של מתנול דרך בקרת מקוון/לא מקוון או קדימה/אחורה. בין אסטרטגיית ההפעלה הסטטיסטיות, העיקריות כוללות μ-stat, DO-stat (מימן דיסולב), methanol-stat ו-biomass-stat.

1.1 μ-stat

אסטרטגית μ-stat שומרת על המסה הביולוגית יציבה על ידי בקרת μ, מה שמעודד חזרה ונחקרת השפעת μ על ביטוי חלבונים. עם זאת, אין לה שליטה ישירה במתנול וב-DO, מה שיכולים לגרום לאכיפת מתנול וליצור ROS.

1.2 DO-stat

האסטרטגיה של DO-stat מנהלת באופן עקיף את זרימת המתאолос על ידי בקרת החמצן الذ镕 כדי להחזיק את הרמת החמצון, אך לא קובעת את ריכוז המתאולוס והקצב הגידולי, מה שיכול להשפיע על מחקר ביטוי חלבונים. חמצון מהווה אתגר בפרמנטציה אירובית, ובזמן שהוספת חמצן טהור יכולה להיות יקרה וסامة, שיפור לחץ הוא גישה כלכלית יותר שיכולה גם לשפר את פעילות החלבון.

1.3 Methanol-stat

בקרת לקויה של ריכוז המתאולוס מציבה מגבלות עבור האסטרטגיות של μ-stat ו-DO-stat. אסטרטגיות סטטיסטיות של מתאולוס, שפועלותemode כיב/הדלק, נוטים להיווצרויות ושאינן די מדויקות. בניגוד לכך, מנהלי PID מציעים בקרת מדויקת יותר של ריכוז המתאולוס, מה שמשפר את יעילות הפרמנטציה הכוללת.

1.4 Biomass-stat

האסטרטגיה של biomass-stat מגדירה את היחס בין ביומס למחמצת מתנול, ומיטיבה את קצב האספקה של המתנול כדי להגדיל את תוצרת הפרוטאין. השמירה על הביומס בזמן אמת היא יותר מעשית, עם שיטת הזרימת זרמים (flow cytometry) כהעדיפה. בקנה מידה של 1000 ליטרים, מיטיבת קצב האספקה של המתנול משפרת באופן משמעותי את פעילות האנזים, את התפוקה והייצור, ומעלימה את התזונה בכוסות ניסוי.

אסטרטגיית אספקה משותפת

גליצרול, כמונע של המופעל AOX1, חייב להישאר מאוכל לחלוטין לפני התחלתו של המתנול כדי למנוע דיכוי בתהליך ייצור הפרוטאין. חומרים משניים עשויים לשפר את פעילות האנזים, אך עודף גליצרול יכול להזיק לצמיחה לביטוי. סורביטול, חומצה אסקורבית, מנטיתול ואחרים יכולים להחליף את הגליצרול, להפחית פרוטוליזה, זמן גדילה ולשפר את הביטוי של הפרוטאין.

הבנק של התא מחייב אימוץ שיטות שמירה מתאימות והצבה בסביבה מתאימה כדי להבטיח את יציבות תכונות התא. Yaohai Bio-Pharma יכולה לקיים את דרישות השמירה על סטוקים גליצרול (באמצעות מקררים בטמפרטורה נמוכה מאוד או חנקן נוזלי) ושימור ייבוש קפוא של מחוגר ו-E. coli.

סטרטגיה המניעה הגבלה

ב-Pichia pastoris, תנאים מגבילים כמו רמת DO נמוכה, ריכוז מתייל אלכוהול, וגבול האוקסיגן מגדילים את ביטוי החלבון הזר. תנאים מגבליי אוקסיגן מפעילים את מופע AOX1 באמצעות הצטברות מתייל אלכוהול, מה שמעלה את תוצרת החלבון תוך הפחתת החום. אינדוקציה בטמפרטורה נמוכה מגדילה את התוצרת, פעילות, יציבות ובידוד התאים אך מוסיפה עלויות קריאה. שליטה ב-pH והגבלה של חנקן גם מסייעת לביטוי, עם זהירות כדי להימנע מבעיות בפעולה. הגבלת חנקן מגדילה במיוחד את תקיעותpecific של תוצרת החלבון.

יאוהאי ביופרמה מחפשת גם כן שותפים גלובליים, מוסדיים או אישיים, ומציעה את התשלום הקומפטיטיבי ביותר בתעשייה. אם יש לכם שאלות כלשהן, אנא לא/Setezesist ליצור איתנו קשר: BD@yaohaibio.cn