Otključavanje tajni visokokvalitetne ekstrakcije plazmida

Ekstrakcija plazmida ključna je za istraživače. Kao genski vektori, plazmidi su vitalni u istraživanju cjepiva i genskoj terapiji, gdje je kvaliteta važna. Ključni čimbenici kvalitete uključuju supersmotani udio i sadržaj endotoksina. Propisi se razlikuju: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, s <5% linearne/otvorene kružne DNK. Klijenti često preferiraju ≥95% supercoiled. Razine endotoksina su: istraživanje (>50 EU/µg), transfekcija (<50 EU/µg) i bez endotoksina (<0.1 EU/µg).

Supersmotana plazmidna DNA

Plazmidi iz Escherichie coli uključuju superzamotanu (SC), otvorenu kružnu (OC) i linearnu (L) DNA. Visoki udio SC povećava učinkovitost i ekspresiju transfekcije. Na primjer, transfekcija SC plazmida od 85.45% je 2.5x veća, a ekspresija HGF plazmida od 93.28% SC je 1.8x veća, što potvrđuje superiornost SC DNA.

Otvorena cirkularna DNA: Kada jedan lanac dvolančane DNA pukne, superzamotana struktura postaje labava, formirajući otvoreni cirkularni plazmid većeg volumena koji migrira najsporije tijekom elektroforeze i nalazi se na vrhu.

Linearna DNA: Kada oba lanca plazmidne DNA puknu, formira se linearna struktura, s relativno manjim volumenom koji migrira brže od otvorene kružne DNA, ali sporije od supersmotane DNA, koja se nalazi na drugom mjestu.

Supersmotana DNK: Dvije spirale se isprepliću, uvijajući se u supersmotanu strukturu temeljenu na spirali DNK. Ima najmanji volumen i najbrže migrira tijekom elektroforeze, smješten na dnu.

Kvantitativna analiza supersmotanog udjela

Laboratoriji koriste elektroforezu u agaroznom gelu (AGE) i Gel-Pro Analyzer za procjenu udjela superzavoja putem slika elektroforeze. Jedna slika prikazuje 97.539% SC DNK, dok druga prikazuje 63.833% SC i 36.167% OC DNK (linearna DNK nije vidljiva).

Tajna endotoksina u plazmidima

Endotoksin je sastavni dio vanjskog sloja stanične stijenke Gram-negativnih bakterija, koji se oslobađa nakon bakterijske smrti ili lize, a sadrži toksični lipopolisaharid A. Tijekom ekstrakcije plazmida, endotoksin ulazi u otopinu za lizu, utječući na učinkovitost transfekcije i izazivajući nespecifične imunološke odgovore, vodeći do lažno pozitivnih rezultata u eksperimentima.

Kvantitativna i kvalitativna analiza endotoksina

Limulus amebocyte lysate (LAL) test otkriva endotoksin putem aglutinacije s 2-keto-3-deoksioktonskom kiselinom (KDO) u lipopolisaharidima (LPS). To je kvalitativno i polukvantitativno, što ukazuje na prisutnost endotoksina kroz koagulaciju ili promjenu boje kada se pomiješa s uzorcima.

Yaohai Bio-Pharma nudi supersmotane plazmide bez endotoksina. Outsourcing Yaohaiju povećava učinkovitost transfekcije i izražavanja. Isporučeni plazmidi imaju ≥95% SC udjela (prosječno 85%±10%) i razine endotoksina ≤0.1, ≤0.01 ili ≤0.005 EU/μg.

Također aktivno tražimo institucionalne ili pojedinačne globalne partnere. Nudimo najkonkurentnije naknade u industriji. Ukoliko imate pitanja, slobodno nas kontaktirajte: [email protected]