Priprema IVT mRNA

Transkripcija in vitro (IVT) je poželjna metoda za pripremu mRNA, sposobna proizvesti mikrograma do miligramova mRNA na laboratorijskoj razini. Za istraživačke svrhe, dobavljači reagensa su razvili fleksibilne IVT reakcijske sustave koji su prilagođeni mRNA umjerene dužine (1000-4000 nukleotida).

U ovom članku sažet ćemo transkripciju in vitro (IVT) mRNA, uključujući konvencionalni IVT reakcijski sustav koji se koristi na laboratorijskoj razini i IVT reakcijski sustav koji je prilagođen ultra-dugoj mRNA (>9000 nukleotida).

Skladišta omogućuju kodranskripcijsko zaklapanje s CleanCap AG i smanjuju imunogenost s m1ψ. DNase I uklanja ostatak DNA. Niska dobiv može biti uzrokovana lošim mešanjem, oksidacijom reagensa ili problemima s DNA šablonom, što se može smanjiti centrifugiranjem, čerpanjem novih reagensa, kontrolama i prilagođavanjem količine šablona/vremena reakcije.

Yaohai Bio-Pharma pruža različite unaprijed izrađene IVT RNA proizvode (tekućina/zamrznuta prašnina) i LNP gotove proizvode, koji kodiraju proteine poput fluorescirajućih proteina (eGFP, mCHERRY), luciferaze, rekombinaze Cre i antigena OVA, kako bi se ispunile različite eksperimentalne ili projektnje potrebe.

IVT sustav za ultra-dugacko mRNA

Uobičajeni IVT možda neće raditi za prekomjereno dugačko mRNA (>9000 nt). Potrebno je duboko shvaćanje i racionalna prilagodba IVT komponenti.

DNS šablon: Linearizirani plazmidi ili PCR proizvodi s odgovarajućim promotornim nizovima, otopljeni u RNase-slobodnoj H2O. Preporučuje se koncentracija DNS šablona veća od 40 nM za optimalne uvjete IVT-a.

DTT: Održava aktivnost enzima tijekom transkripcije. Treba dodati svježi DTT u reakcijski bufer za optimalnu aktivnost enzima.

RNase inhibitor: Inhibira aktivnost RNase i održava stabilnost mRNA-a.

T7 RNA polimeraza: Katalizira transkripciju DNA u RNA, odgovarajuću promotor skim nizu. Aktivnost T7 RNA polimeraze utjecaju pH i magnezijumski ioni.

Magnezijumske Ijone (Mg2+): Kofaktor za RNA polimerazu. Preniske koncentracije smanjuju učinkovitost transkripcije, dok su previsoke koncentracije uzrokuju degradaciji RNA. Slobodni [Mg2+] trebaju se prilagoditi na temelju koncentracije nukleotida. Svaki nukleotid vezuje jedan [Mg2+], stoga bi koncentracija [Mg2+] trebala biti veća od ukupne koncentracije nukleotida.

Nukleozidski Trifosfat (NTP): Kao substracti, NTP-ovi su osnovne jedinice RNA. Koncentracije NTP-a iznad 7 mM imaju pozitivan utjecaj na proizvodnju mRNA-a.

Spermidin: Stabilizira DNA-enzim komplekse i stimulira transkripcijske reakcije; međutim, previsoke koncentracije imaju inhibicijski efekti. Preporučena koncentracija spermidina je između 1 i 3 mM.

Inorganicki Pirofosfataza (PPase): Dodano u IVT reakcije kako bi se spriječilo nagomilavanje jonova neorganiziranog pirofosfata (PPi), izbjegavajući njihovu šelaciju s Mg2+ i osiguravajući dovoljno slobodnog Mg2+.

Koristeći inovativnu tehnologiju i iskustvo u IVT mRNA-u, Yaohai Bio-Pharma pruža uslugu jednostruke IVT RNA usluge, obuhvaćajući dizajn nizova, pripremu IVT RNA (s m1ψ modifikacijama), ciklizaciju RNA, čišćenje, zamarivanje, LNP enkapsulaciju i testiranje kvalitete.

Također aktivno tražimo globalne partnerе iz institucija ili pojedince. Ponuditi ćemo najbolju kompenzaciju u industriji. Ako imate bilo kakva pitanja, slobodno nas kontaktirajte: [email protected]