Priprema IVT mRNA

In vitro transkripcija (IVT) je poželjna metoda za pripremu mRNA, sposobna dati mikrograme do miligrama mRNA u laboratorijskim razmjerima. Za potrebe istraživanja, dobavljači reagensa razvili su svestrane IVT reakcijske sustave prikladne za mRNA umjerene duljine (1000-4000 nukleotida).

U ovom ćemo članku sažeti in vitro transkripciju (IVT) mRNA, uključujući konvencionalni IVT reakcijski sustav koji se koristi u laboratorijskim razmjerima i IVT reakcijski sustav prikladan za ultra-dugu mRNA (>9000 nukleotida).

Kompleti omogućuju kotranskripcijsko ograničavanje s CleanCap AG i smanjuju imunogenost s m1ψ. DNaza I uklanja zaostalu DNK. Nizak prinos može biti posljedica lošeg miješanja, oksidacije reagensa ili problema s predloškom DNK, koji se mogu ublažiti centrifugiranjem, svježim reagensima, kontrolama i podešavanjem količine predloška/vremena reakcije.

Yaohai Bio-Pharma nudi razne prefabricirane IVT RNA proizvode (tekući/smrznuti sušeni prah) i LNP gotove proizvode, koji kodiraju proteine ​​kao što su fluorescentni proteini (eGFP, mCHERRY), luciferaza, rekombinaza Cre i antigen OVA, kako bi zadovoljili različite eksperimente ili projekte potrebe.

IVT sustav za ultra-dugu mRNA

Konvencionalna IVT možda neće raditi za predugu mRNA (>9000 nt). Potrebno je duboko razumijevanje i racionalna prilagodba IVT komponenti.

Predložak DNK: Linearizirani plazmidi ili PCR proizvodi s odgovarajućim sekvencama promotora, otopljeni u H2O bez RNaze. Za optimalne uvjete IVT preporučuje se koncentracija DNA šablona veća od 40 nM.

DTT: Održava aktivnost enzima tijekom transkripcije. Svježi DTT treba dodati u reakcijski pufer za optimalnu aktivnost enzima.

Inhibitor RNaze: Inhibira aktivnost RNaze i održava stabilnost mRNA.

T7 RNA polimeraza: Katalizira transkripciju DNA u RNA, koja odgovara sekvenci promotora. Na aktivnost T7 RNA polimeraze utječu pH i ioni magnezija.

Ioni magnezija (Mg2+): Kofaktor za RNA polimerazu. Preniske koncentracije smanjuju učinkovitost transkripcije, dok previsoke dovode do degradacije RNK. Slobodni [Mg2+] treba prilagoditi na temelju koncentracije nukleotida. Svaki nukleotid kelira jedan [Mg2+], tako da bi koncentracija [Mg2+] trebala premašiti ukupnu koncentraciju nukleotida.

Nukleozidni trifosfati (NTP): Kao supstrati, NTP su osnovne jedinice RNK. Koncentracije NTP iznad 7 mM imaju pozitivan učinak na proizvodnju mRNA.

Spermidin: Stabilizira DNA-enzimske komplekse i potiče reakcije transkripcije; međutim, prekomjerne koncentracije imaju inhibitorne učinke. Preporučena koncentracija spermidina je između 1 i 3 mM.

Anorganska pirofosfataza (PPaza): Dodan IVT reakcijama kako bi se spriječilo nakupljanje anorganskih pirofosfatnih iona (PPi), izbjegavajući njihovu kelaciju s Mg2+ i osiguravajući dovoljno slobodnog Mg2+.

Koristeći pionirsku tehnologiju i IVT mRNA iskustvo, Yaohai Bio-Pharma pruža uslugu IVT RNA na jednom mjestu, koja obuhvaća dizajn sekvence, IVT RNA prep (s m1ψ modovima), RNA ciklizaciju, pročišćavanje, sušenje smrzavanjem, LNP enkapsulaciju i testiranje kvalitete.

Također aktivno tražimo institucionalne ili pojedinačne globalne partnere. Nudimo najkonkurentnije naknade u industriji. Ukoliko imate pitanja, slobodno nas kontaktirajte: [email protected]