Inovativne tehnike sklapanja za sintezu gena velikih razmjera

Tehnologija sastavljanja za sintetiziranje velikih fragmenata DNK od nule je kamen temeljac sinteze gena, koja obuhvaća metode kao što su BioBrick™, TAR, BglBrick, Golden Gate, Gibson sklop, CPEC i Overlap PCR. Zbog ograničenja trenutne tehnologije u preciznom sintetiziranju DNA genske duljine u jednom koraku, potrebno je kombinirati in vitro i in vivo tehnike sastavljanja za sastavljanje oligonukleotidnih fragmenata sintetiziranih u segmentima u dugačke fragmente DNA.

Tehnike sklapanja in vitro

Razvrstavaju se u različite metode na temelju veličine fragmenata i karakteristika sekvence, sa zajedničkim zahtjevom za korištenjem enzima alata. Preklopni PCR, koji se temelji na metodi DNA polimeraze, jednostavan je i brz. Metode BioBrick i BglBrick, koje se oslanjaju na izoshizomere, omogućuju standardizirano sastavljanje, iako je metoda BioBrick neprikladna za fuzijske proteine. Metoda kloniranja Golden Gate, koja se temelji na restrikcijskim enzimima tipa IIS, omogućuje učinkovito bešavno povezivanje više fragmenata. Gibsonova metoda sastavljanja, koja koristi kombinaciju višestrukih enzima alata, omogućuje besprijekornu ligaciju s veličinama fragmenata koji dosežu nekoliko stotina kb. Standardizirani dizajn komponenti DNK povećava stopu iskorištenja postojećih fragmenata.

Tehnike sklapanja in vivo

Iako vitro skupljeni fragmenti mogu doseći veličinu od nekoliko stotina kb, prinos je često nedovoljan, što zahtijeva pojačanje pomoću organizama kao što su Escherichia coli. U sastavljanju fragmenata koji premašuju 20 kb često se koriste rekombinantni sustavi unutar organizama, uključujući Bacillus subtilis, kvasac i modificirane bakterije. Kvasac, kao često korišteni domaćin, već je mnogo godina poznat po svojoj učinkovitoj sposobnosti homologne rekombinacije. Može se koristiti za sastavljanje umjetnih kromosoma duljine do nekoliko megabaza (Mb). Osim toga, Saccharomyces cerevisiae pokazuje izvanrednu toleranciju na duljinu kromosoma, pružajući teoretsku osnovu za korištenje kvasca za izgradnju ultra-dugih kromosoma u višim organizmima.

Aplikacije

Yaohai Bio-Pharma prvenstveno koristi dvije metode sklapanja za sintezu gena: sklapanje ligaze i okupljanje DNA polimeraze. Metoda sklapanja ligaze povezuje preklapajuće i hibridizirane 5'-fosforilirane oligonukleotidne fragmente u dvolančanu DNA pomoću DNA ligaze. Metoda sastavljanja polimeraze koristi DNA polimerazu za produljenje preklapajućih fragmenata oligonukleotida kroz hibridizaciju, dobivanje mješavine različitih duljina i konačno umnožavanje uspješno sastavljenih fragmenata pune duljine pomoću početnica. Yaohai može pomoći klijentima da zadovolje specifične zahtjeve u sintezi gena.

Također aktivno tražimo institucionalne ili pojedinačne globalne partnere. Nudimo najkonkurentnije naknade u industriji. Ukoliko imate pitanja, slobodno nas kontaktirajte: [email protected]